植物基因槍法轉基因技術

2023年12月14日發(作者：羨魚)

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基因工程隨堂作業

題 目：植物基因槍法轉基因技術

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植物基因槍法轉基因技術

轉基因技術是指將一個或更多的目的基因導入受體中,使該基因在受體生物中得以表達。隨著植物基因工程技術的發展,20世紀80年代末,一項新的基因轉化技術---基因槍技術應運而生。由于基因槍技術安全性好、效率高,其應用范圍迅速從植物基因工程、動物基因工程擴大到基因治療和基因免疫領域,使細胞的研究發展到在體操作。目前,已有基于基因槍技術的多種基因疫苗進入臨床研究階段。

1.基因槍技術的轉化原理及操作

用包裹DNA的金屬小顆粒轟擊受體組織,使DNA實現穿壁并被導入眾多細胞中,稱為“基因槍法”(或微粒轟擊技術)。包裹著DNA的金屬粒加速到一個很高的速度后(通常需要部分真空以減少顆粒的速度損失)穿透受體組織,一般可以穿透2,3層細胞。最初是利用爆炸力在槍管里推動一個大的塑料微粒載片,片上放有包裹著DNA的微粒懸液,后來用一個中間有洞的板擋住高速運動的載片,載片上的微粒穿過洞進入裝有受體組織的真空腔中,并且打入或者穿過運動路徑上的目標組織,微粒上攜帶的外源DNA分子就可能進入細胞,并進行表達。基因槍根據驅動力可以分為3種基本類型。

(1)火藥式基因槍是最原始的類型,由美國康乃爾大學Sanford等人于1987設計制造。這種基因槍自使用以來已先后將外源基因導入到玉米、小麥和水稻等多種植物材料中,獲得了瞬間的或穩定的表達。它的主體由滑膛腔、真空轟擊室和阻彈部件構成。塑料子彈的前端載有大量攜帶了外源目的基因的微彈,當樣品爆炸時,子彈帶著微彈向下高速運動,至阻擋板時子彈被阻礙,其前端的微彈依靠慣性繼續高速運動,擊中轟擊室的靶細胞。該裝置的特點是,粒子速度主要通過貨樣的數量及速度調節器控制,不能無級調控,可控程度低。

(2)壓縮氣體型基因槍的動力系統以氦氣、氮氣和二氧化碳氣驅動。一種方法是把載有外源目的基因的微彈懸滴在一張金屬篩網上,在高壓氣體的沖擊下,射入受體靶細胞;另一種方法是把外源目的基因與微彈混合后霧化,再由高壓氣體驅動射入受體靶細胞,這種系統的靶范圍可精確控制到0。15mm左右。

(3)高壓放電型基因槍利用電加速器通過高壓放電將微彈射入受體靶細胞,其特點是可無級調控,通過調節放電電壓來控制粒子的速度和入射速度。

2.基因槍技術的應用

最早應用基因槍進行基因轉化并獲得成功的是Klein等人,他們用基因槍轉化洋蔥表皮的細胞,并獲得了成功。后來McCabe將目的基因包于鎢粉上,電轟擊大豆莖尖分生組織,結果約有2j的組織通過器官發生途徑獲得再生植株,在子代中檢測到了外源基因。1989年用氣動式基因槍轉化煙草等植物獲得成功,且得到了瞬時表達。大麥的轉基因技術與其他植物相比發展較慢,Kartha等用大麥的細胞和組織進行培養,檢測到報告基因的瞬時表達。基因槍技術還在禾谷類作物中得到廣泛應用,克服了單子葉植物的遺傳轉化受農桿菌寄主限制的局限性。Gordon Kamm等用基因槍技術將GUS報告基因和PAT選擇性基因導入基因型為A188iB73的玉米胚性懸浮細胞系,首次獲得轉基因玉米的可育植株,使轉基因玉米技術

1 受到很大的關注。賈柿榮等用國產火藥式基因槍實現了質粒pBH21對玉米花粉的轉化,經人工授粉,獲得了轉基因植株。

基因槍法不僅可用于直接轟擊懸浮細胞系和花粉,還可以用來轟擊單個細胞。Rasmusn等利用氦動基因槍,用含質粒pBC-17或PBAR-GUS的完整大腸桿菌DH5-和含質粒pNY的根瘤農桿菌A208轟擊玉米細胞,獲得數個瞬間轉化體,其中有6個是穩定的。基因槍技術在對水稻進行基因轉化的應用中也獲得了成功。Oard首先應用該技術獲得了轉基因水稻的愈傷組織,檢測到了GUS基因的瞬時表達。同年,

Cao用基因槍技術轉化水稻成熟胚,成功獲得了轉基因水稻植株。小麥是栽培面積最大的重要糧食作物,但卻是最后一個獲得轉化成功的禾谷類作物。Vasil等首次報道用基因槍技術將GUS基因和Bar基因轉入長期培養的小麥胚性愈傷組織中。

3.基因槍技術的優缺點

3.1基因槍技術的優點是:

(1)無宿主限制,能轉化任何植物,特別是那些由原生質體再生植株較為困難和農桿菌感染不敏感的單子葉植物,提高了禾谷類植物的轉化效率。

(2)靶受體類型廣泛,不受基因型的限制,適用于不同的物種以及同一物種的不同品種,能轉化植物的任何組織或細胞。

(3)可以轉化線粒體、葉綠體等植物的不同細胞器。外源DNA進入細胞質后很難穿過雙層膜在細胞器,用基因槍技術轉化這類細胞器,轉化頻率高,重復性好,是目前該領域研究中最常用和最有效的DNA導入技術。

(4)可以快速獲得第一代種子,方法簡便易行。基因槍轉化法在無菌條件下用載有外源基因的金屬顆粒

轟擊受體材料,便可以進行篩選培養,不需要進行原生質體的制備分離與培養的繁瑣工作。

(5)可控程度高,采用高壓放電或高壓氣體驅動,可根據實驗需要,將金屬顆粒(載體)射入特定層次的細胞,提高了遺傳轉化的效率。

3.2基因槍技術的缺點是:

(1)基因槍轟擊的隨機性導致轉化效率不高。

(2)基因插入往往是多拷貝隨機整合到受體基因組中,可能發生多種方式的重排。

(3)同源序列能以DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA 的方式相互作用,導致轉錄或轉錄后水平的基因沉默。

(4)轟擊過程中可能造成外源基因的斷裂,使插入的基因成為無活性的片段。

(5)出現非轉化體或嵌合體的可能性較高。

(6)應用成本較高。

4.基因槍轉基因技術的發展前景

目前,作物基因工程正處于飛速發展時期,越來越多的轉基因植物產品進入市場。人們可以利用基因槍技術轉化培養特定農藝性狀基因(如抗病、抗旱、抗寒、抗澇、抗蟲、耐

2 鹽、耐藥等)以及能夠改良食品質量(高蛋白、高油酸、含維生素等)的基因作物,還可以利用該技術來開發和利用具有特定用途(如生物制藥)的作物。

同樣,利用基因槍法獲得轉基因生物也具有廣闊的發展前景。利用基因槍法轉基因雖然成本較高,但如果資源共享做得好,尤其是隨著科學技術特別是分子生物學技術的飛速發展,基因槍法的成本會不斷下降,以往的發展已經很好地證明了這一點。另外,基因槍法轉基因在宿主細胞的選擇方面無任何限制,有著巨大的發展空間。例如,農桿菌法轉基因受宿主細胞選擇的限制較大,因而主要應用在雙子葉植物的轉基因中,但基因槍法無此限制。基因槍法在轉基因植物、轉基因藥物、生物反應器、轉基因動物組織器官移植、供體以及基因治療和基因免疫方面均有廣泛的應用,尤其對家禽、魚類和昆蟲的應用研究以及對乳腺生物反應器和昆蟲桿狀病毒構建的生物反應器的研究,均顯示了巨大的經濟效益和社會效益。

目前,基因槍法轉基因技術仍有許多有待解決的問題,如對于基因槍應用的最佳條件的探索、進一步提高在大哺乳動物中的轉染效率以及對基因槍轉基因整個轉移過程的微觀機制的研究等,還需要進行深入的探索。

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