植物基因轉化常用方法

2023年12月14日發(作者：競聘自我介紹)

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一. 植物遺傳轉化的方法

植物遺傳轉化技術可分為兩大類：一類是直接基因轉移技術，包括基因槍法、原生質體法、脂質體法、花粉管通道法、電激轉化法、PEG介導轉化方法等，其中基因槍轉化法是代表。另一類是生物介導的轉化方法，主要有農桿菌介導和病毒介導兩種轉化方法，其中農桿菌介導的轉化方法操作簡便、成本低、轉化率高，廣泛應用于雙子葉植物的遺傳轉化。

二.農桿菌介導的基因轉化方法

（一）農桿菌的Ti質粒與T-DNA的整合機制

幾乎所有雙子葉植物都容易受到土壤農桿菌感染，而產生根瘤。它是一種革蘭氏陰性土壤桿菌（A. tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）質粒介導的。農桿根瘤菌之所以會感染植物根部是因為植物根部損傷部位分泌出酚類物質乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質可以誘導Vir（Virulence region)基因的啟動表達，Vir基因的產物將Ti質粒上的一段T－DNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產物則與單鏈T－DNA結合，形成復合物，轉化植物根部細胞。T－DNA上有三套基因，其中兩套基因分別控制合成植物生長素與分裂素，促使植物創傷組織無限制地生長與分裂，形成冠癭瘤。第三套基因合成冠癭堿，冠癭堿有四種類型：章魚堿（octopine）、胭脂堿（nopaline）、農桿堿（agropine）、琥珀堿（succinamopine），使農桿菌生長必需的物質。

1. Ti質粒的結構

在發現根瘤農桿菌誘發冠癭瘤的本質是Ti質粒后，Ti質粒便成為冠癭瘤形成基因鑒定與分析的主要研究對象。

Ti質粒大約在160～240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區在36kb左右。除此之外，Ti質粒上還存在Con區（region encoding conjugation)和Ori區（origin of replication)。

T-DNA上共有三套基因和左右兩個邊界，LB和RB是長為25bp的末端反復重復順序，在切除及整合過程具有重要意義。

tms由兩個基因組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）

tmr由一個基因組成iptz：

tmt由若干基因構成，合成稀有氨基酸衍生物，稱為opines。它有三個成員：

octopine＝精氨酸與丙酮酸的縮合物

Napaline＝精氨酸與－酮戊二酸的縮合物

Agropine＝谷氨酸與二環糖的縮合物

據此可將Ti質粒分為三大類，感染的植物誘導合成這些有機堿，但不能利用它們，其分解酶基因在Ti質粒上，分解產物為氨基酸和糖類，供根癌農桿菌使用作為氮源及碳源。

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