轉基因方法

2023年12月14日發(作者：形容雪景的詩句)

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轉基因方法

一、 基因槍法：

1、 綜述：

基因槍法又稱為高速微彈法、微粒搶法、微粒轟擊法，是由康奈爾大學的Sanford等于1987年首次研制出的火藥引爆基因槍，并與該校工程技術專家Wolf及Kallen合作研究出的一種基因轉移的新方法。1990年美國杜邦公司推出商品基因槍PDS-1000系統。在此期間，高壓放電、壓縮氣體驅動等各種基因槍相繼出現，并都在重復的實踐中得到改進和發展。其改進的核心是粒子加速系統，以提高射彈的可控度，即粒子速度和射入的濃度等。

2、基本原理：

其基本原理是將外源DNA包被在微小的金粒或鎢粒表面，然后在高壓的作用下微粒被高速射入受體細胞或組織。微粒上的外源DNA進入細胞后，整合到植物染色體上，得到表達，從而實現基因的轉化。

根據基因槍的動力系統，可將它們分為三種類型：一類是以火藥爆炸力為加速動力，其顯著特征是塑料子彈和阻擋板。塑料子彈前端載放已沉淀有DNA的鎢金粉。當火藥爆炸時，塑料子彈帶著鎢金粉向下高速運動，至阻擋板時，塑料子彈被阻遏，而其前端的鎢金粉粒子繼續以高速向下運動，擊中樣品室的靶細胞。其粒子的速度主要是通過火藥的數量及速度調節器控制，不能做到無級調整，可控度較低。

第二類是以高壓氣體作為動力，如以氦氣、氫氣、氮氣等。其工作原理是把載有DNA的鎢金粉噴灑在一張微粒載片上，電極間懸滴眾著微水滴。在壓縮空氣的沖擊下，微水滴霧狀噴射，驅動載片。當載片受阻于金屬篩網時，載有DNA的鎢金粒繼續向下沖擊射入細胞。

第三類是以高壓放電為驅動力。其最大優點是可以無級調速，通過變化工作電壓，粒子速度及射入濃度可準確控制，使載有DNA的鎢金粉粒子能到達具有再生能力的細胞層。

3、步驟：

（1）微粒體的洗滌。 取60-100mg鎢或金粉，溶于1ml無水乙醇中，用超聲波振蕩洗滌。微粒體處理后可在密閉條件下室溫貯存一周。離心除去乙醇，密閉貯存于室溫中，備用，保存時間不要超過一周。

（2）DNA微粒載體的制備。

（3）靶外植體材料準備。 在無菌條件下截取靶外植體，放于樣品皿中，外植體大小按基因槍要求選擇；在無菌條件下把靶外植體放入基因槍的樣品室，并對準子彈發射中心。

（4）DNA微彈轟擊，按照不同的基因槍說明書操作。

（5）轟擊后外植體的培養。DNA微彈轟擊后立刻轉入相應的培養基中培養，以免材料脫水加重細胞受傷害的程度，獲得再生植株。

4、影響因素：

（1）基因槍轟擊參數，如基因槍類型、氦氣壓力、基因槍真空度、包裹金屬粒子類型、金屬粒子大小、載體膜位置、靶材料位置轟擊次數、微粒加速裝置參數等都會影響轉化效率的高低。其中金屬粒子以金粒效果最好、94.92kPa左右的氦氣真空度為佳。

（2）轉化質粒的參數，如轉化質粒的純度要高、且濃度不宜過大。加入一定量的氯

化鈣與亞精胺對質粒的包被有促進作用。

（3）轉化材料的類型。對于不同物種，它都有其適應的轉化材料，如水稻胚性愈傷組織和配型懸浮系細胞的基因槍轉化效率要高于幼胚的轉化效率。

（4）啟動子、選擇培養基類型等， 其中啟動子是調節外源基因在轉化細胞中表達的重要因素，不同啟動子調控的基因在受體材料中的表達水平差別很大。

5、優缺點： 優點：

（1）無宿主限制，對雙子葉和單子葉植物以及動物和微生物都同樣適用。

（2）靶受體類型廣泛。基因槍技術可以選用易于再生的受體，繞過原生質體再生的困難。它不僅以原生質體、葉圓片為靶受體，而且懸浮培養細胞，莖或根切段以及種子胚、分生組織、幼穗、愈傷組織、花粉細胞等幾乎所有具有潛在分生能力的組織或細胞都可用基因槍進行轉化。

（3）可控度高。近代的高壓放電或高壓氣體可調控微彈的速度和射入的濃度，可以較高的命中率把DNA微粒載體射入特定層次的細胞。

（4）操作十分簡便快速。 缺點：

（1） 轉化效率低，多在0.1%-1%之間，這就增加了選擇難度； （2） 儀器設備昂貴，轉化費用高； （3） 不易獲得再生植株。

6、應用前景：

（1）植物基因轉化：

目前已有十幾種植物采用了此技術獲得了轉基因植株，如小麥、玉米、水稻等，顯

示了其廣闊的前景。近年來，多基因轉化是一個新亮點，由于基因槍法轉化容量大，一次能導入12-14個不同質粒，因而被認為是實現多基因轉化的較理想的方法。

（2）將外源基因導入植物細胞的細胞器

在植物細胞中有三套遺傳系統，即在細胞核、線粒體、葉綠體中都有自己的遺傳物

質。它們相互調節，共同調控者細胞的生命活動。細胞器的遺傳系統同樣具有重要作用，因此通過細胞器的基因轉化改造生物同樣是一條可行的途徑。現已證明基因槍法可將外源基因導入細胞器，并能得到穩定表達，因此，基因槍為細胞器的基因轉化開拓了一片新領域。

（3）植物基因表達調控研究：

利用基因槍技術為外源基因導入特定組織提供了可能，因此可以用于研究植物的發育及調控。如果把外源的特定基因導入不同的細胞或不同發育時期，則可以研究其基因表達的特點。

四、 花粉管通道法：

1、綜述：

在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，并進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發育而成為帶轉基因的新個體。該方法于80年代初期由我國學者周光宇提出，我國目前推廣面積最大的轉基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優點是不依賴組織培養人工再生植株，技術簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規育種工作者易于掌握。

2基本原理： 花粉管通道法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。這一技術原理可以應用于任何開花植物。

3、 步驟：

（1） 外源DNA制備：

a、 從植物提取DNA：取供體植物的幼葉、幼穗等為試材，提取總DNA，然后進

行純化和酶切，之后制備DNA導入液；

b、 從細菌中提取質粒DNA：已構建的中介載體一般克隆在大腸桿菌中，因此可

以直接從大腸桿菌中提取質粒DNA，并酶切后制備DNA導入液； c、 從農桿菌中提取已重組構建的Ti質粒，并酶切后制備DNA導入液； （2） 分析受體植物受精過程及時間，確定導入外源DNA的時間及方法。 （3） 外源DNA導入受體植物：

方法一：柱頭涂抹法 未授粉前，先用DNA導入液涂抹柱頭，然后人工授粉，迅速套袋。

方法二：花粉粒吸入法 提前去雄套袋隔離，花粉粒首先用DNA導入液處理，使外源DNA吸入花粉粒，然后對受體植物進行人工授粉套袋。 （4） 后代材料處理：

經外源DNA處理獲得的種子與供體、受體植物的子代點播在同一試驗田，進行田間試驗。

4、 影響因素：

（1） 受體植物的受精過程及時間規律是花粉管導入的關鍵因素，要精確掌握，才能

達到外源DNA導入的目的。

（2） DNA導入液的濃度、pH值等均影響轉化率。

（3） DNA的分子結構及其片段大小對轉化率也有重要影響。環狀分子難以轉化，大

片段DNA轉化率低，片段太小不能保證完整基因存在，因此要使用適宜的DNA片段。

5、 優缺點：

優點：（1）利用整體植株的卵細胞、受精卵或早期胚細胞轉化DNA，無需細胞、原生質體等組織培養和誘導再生植株等一整套人工培養過程。 (2)方法簡便，可以大田、盆栽或溫室中進行。 （3）單胚珠和多胚珠的單雙子葉植物均可應用。 （4）縮短了育種時間。

（5）可以任意選擇品種進行外源DNA的導入，達到目的性狀基因的轉移。可以保留受

體的優良性狀，無需顧慮體細胞變異的問題。

缺點：

（1） 篩選到的子代可能帶入少量目的性狀基因以外的DNA片段。 （2） 這一技術局限于開花時間才能應用。

（3） 如果是不受單基因或單片段DNA控制的多基因性狀，則不能或很難通過這一技

術導入植物。

6、 應用前景：

該技術的建立開創了整株活體基因轉化的新途徑，近年來又有了很大發展，應用前景廣闊。

五、農桿菌介導法：

1、綜述：

農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤或發狀根。根癌農桿菌和發根農桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，借助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。農桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。

2、基本原理：

農桿菌含有Ti質粒，是較好的基因克隆載體。農桿菌附著到植物細胞后，留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工，剪切、復制，然后轉入植物細胞。

3、步驟：

（1）把含目的基因的外源DNA插入到Ti質粒的T-DNA區，構成重組的質粒分子； （2）將重組型質粒轉化給大腸桿菌細胞；

（3）通過細菌的結合作用，含外源DNA的重組型質粒從大腸桿菌轉移到農桿菌，并與其固有的Ti質粒發生同源重組，外源DNA轉移到固有的Ti質粒上； （4）將農桿菌直接接種在植物的傷口部位或通過植物原生質體共培養方法轉化植物細胞； （5）培養轉化的細胞或組織再生出轉基因植株。

4、影響因素：

（1）植株基因型、年齡是否合適； （2）質粒中virG拷貝數的多少也會造成影響； （3）農桿菌進入植株的方式。

5、優缺點： 優點：

（1） 該轉化系統利用了天然的轉化載體系統，成功率高，效果好；

（2） 在所有的轉化系統中，農桿菌Ti質粒轉化系統是機理研究的最清楚的，方法最

成熟，應用最廣泛；

（3） Ti質粒的T-DNA區可以容納相當大的DNA片段插入；

（4） 整合進植物基因中的T-DNA及插入其間的外源基因不僅能在植物細胞中表達，

而且可根據人們的需要連接不同的啟動子，使外源基因能夠在再生植株的各個組織器官中特異性表達；

（5） 農桿菌Ti質粒轉化系統轉化的外源基因以單拷貝為多，遺傳穩定性好，轉基因

植株能較好地為育種提供中間選育材料。

缺點：

該技術主要應用于雙子葉植物，應用范圍較窄。

6、應用前景：

目前利用農桿菌Ti質粒轉化系統已獲得許多轉基因植物。1983-1994年由農桿菌轉化成功地植物達116種，在植物抗病、抗蟲、抗除草劑和改良植物果實品質等方面都已獲得不少轉基因植物，有的已應用于生產，為提高作物產量、抗逆能力、優質高產良種選育提供了一條誘人的全新途徑，顯示了潛在的美好前景。

基因功能的研究思路

基因功能的研究思路主要包括:

1.基因的亞細胞定位和時空(發育期或梯度藥物處理濃度, 不同組織/器官)表達譜;

2.基因在轉錄水平的調控(可以通過genome walking PCR或通過已有的資源庫尋找該基因的啟動子等轉錄調控區域, 通過單雜交或ChIP等技術, 尋找該基因的轉錄調控蛋白)

3.細胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用復合體的尋找驗證,具體方法有酵母雙雜交,

GST pulldown, co-IP, BRET, FRET, BiFc等等,對該基因的表達產物做一個細胞信號轉導通路的定位)

-of-function & loss-of-function: 也就是分別在細胞和個體水平,做該基因的超表達和knockdown(或knockout), 從表型分析該基因的功能.

功能研究應從完整的分子-細胞-個體三個層次研究, 綜合分析!

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