轉化和轉染

2023年12月14日發(作者：黃發垂髫什么意思)

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轉化和轉染

一、轉化

轉化（transformation）是某一基因型的細胞從周圍介質中吸收來自另一基因型的細胞的DNA而使它的基因型和表型發生相應變化的現象。該現象首先發現于細菌。

1生物轉化簡介

細胞

轉化（transformation）是某一基因型的細胞從周圍介質中吸收來自另一基因型的細胞的DNA而使它的基因型和表型發生相應變化的現象。這現象首先發現于細菌，也是細菌間遺傳物質轉移的多種形式中最早發現的一種，它不同于通過噬菌體感染傳遞遺傳物質的轉導以及通過細菌細胞的接觸而轉移DNA的細菌接合。

病毒

轉化的研究不但在理論上有重要意義，而且在基因工程中是將質粒或病毒載體引入宿主細胞的一種重要手段（見重組DNA技術）。它也可能為育種和遺傳性疾病的基因治療提供新的途徑。

球菌

轉化現象1928年英國學者F．格里菲思在肺炎雙球菌中發現的。他把不產莢膜的無毒的粗糙型肺炎雙球菌和加熱殺死后的產莢膜的有毒的光滑型肺炎雙球菌混合注射小鼠，發現小鼠意外地被感染致死，而且從小鼠的血液中分離出活的產莢膜的肺炎雙球菌。不久又發現產莢膜細菌的無細胞抽提物同樣能在試管中使不產莢膜的細菌變為產莢膜的細菌。1944年美國細菌學家O．T．埃弗里等從元素分析、酶學分析、血清學分析以及生物活性鑒定等方面證實了無細胞抽提物中引起肺炎雙球菌莢膜轉化的轉化因子是脫氧核糖核酸（DNA），第一次為遺傳物質是DNA而不是蛋白質提供了直接的證據。到目前為止，已經在流感嗜血桿菌（Hemophilus influenzae）、鏈球菌（Streptococcus）、沙門氏菌（Salmonella）、奈瑟氏菌（Ne－isria）、根瘤菌（Rhizobium）、枯草桿菌（Bacillus

subti-lis）、大腸桿菌（Escherichia coli）等幾十種細菌中報道了轉化現象，所轉化的性狀包括莢膜、抗藥性、糖發酵特性、營養要求特性等等。它們的轉化因子都是DNA。

2細菌的轉化

染色體

轉化過程包括有轉化能力的染色體DNA片段的吸附、吸收和整合3個階段。外源DNA首先吸附在細菌細胞表面的一些接受位點上。肺炎雙球菌和枯草桿菌等細胞的接受位點沒有專一性，它們能吸附同種的DNA，也能吸附大腸桿菌的DNA。流感嗜血桿菌的接受位點則只能吸附近緣細菌的DNA。DNA在和細菌剛接觸時可以被洗去，在穩定吸附以后便不能洗去，但還能被核酸酶水解。DNA被細胞吸收以后便不能被外源的核酸酶水解。能吸附的DNA主要是雙鏈狀態的，在通過細胞膜進入細胞的吸收過程中DNA分子轉變為單鏈，并以這種形式整合到細菌染色體上。整合過程又可以分5個步驟。

外源基因整合后，通過基因表達使受體細菌的表型發生相應的變化。圖中所示的轉化模式至少對于肺炎雙球菌和枯草桿菌來講是正確的。

質粒 質粒DNA的轉化和染色體DNA的轉化有顯著的不同。在一般情況下前者的轉化效率遠遠低于后者。但如果先用一定濃度的鈣離子處理大腸桿菌細胞，再用質粒DNA和染色體DNA對它做轉化實驗則情況恰好相反。此外，質粒DNA很容易進入去掉了細胞壁的細菌的原生質體，說明對它的吸收并不通過專門的接受位點；質粒DNA的轉化過程沒有整合這一環節。

影響因素

許多因素可以影響轉化效率。受體細菌和供體細菌的親緣關系愈遠則轉化效率愈低，這主要是受吸附位點專一性和染色體的同源程度的影響。DNA分子的聯會是供體DNA整合到受體DNA上的先決條件，聯會一般只發生在同源染色體之間，而親緣關系愈遠則同源性愈低，所以轉化效率也愈低。但細菌間染色體的某些部位如核糖體基因部位在進化過程中很少發生變化，而有些性狀如紅霉素抗性和鏈霉素抗性等都是由于與核糖體有關的基因發生突變而使核糖體蛋白結構改變的結果，所以如果所轉化的是紅霉素或鏈霉素抗性基因或者和它們緊密連鎖的其他基因，則轉化效率便較少受細菌的親緣關系的影響。

轉化效率

同一種細菌也可以由于基因型的改變而改變轉化效率。細菌的限制性核酸內切酶能夠分解外來的DNA，所以如果用限制酶失活的突變型菌株作為轉化受體時可以提高轉化效率。通過篩選也可以得到轉化效率顯著下降的突變型，包括吸附能力、吸收能力和整合能力下降的突變型。某些轉化效率降低的突變型對于紫外線格外敏感，這一性質也是許多喪失了DNA損傷修復能力和喪失重組功能的突變型的特性，可見轉化過程中的DNA的整合和DNA損傷修復以及基因重組都涉及某些相同的酶。

基因型完全相同的細菌可以由于生理狀態的改變而改變轉化效率。能夠吸收外源DNA的生理狀態稱為感受態。許多細菌的感受態都在對數生長期的后期迅速出現，經過一段時間以后便消失。感受態的細菌和非感受態的細菌相比，轉化效率可以高出萬倍。

種族特異

從處于感受態的肺炎雙球菌和鏈球菌中曾分離出感受態因子。感受態因子是蛋白質，它能使非感受態細菌轉變為感受態，并有一定的種族特異性。

某些外界因素可以影響轉化效率，例如一定濃度的鈣離子能夠提高大腸桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌等的轉化效率。又例如流感嗜血桿菌吸收雙鏈DNA分子的最適pH是6.8， pH下降到5.5以下便不能吸收。溫度對于轉化也有影響，在肺炎雙球菌和嗜血流感桿菌中外源DNA的整合在一定范圍內都隨著溫度的上升而提高。

細菌的轉化多數是在人為條件下進行的。在自然條件下已經知道肺炎雙球菌的轉化可以在小鼠體內進行，奈瑟氏菌細胞自溶所釋放的DNA可以轉化周圍的細胞。細菌轉化的生物學意義還有待于進一步研究。在不能或不易通過細菌接合或轉導作遺傳學分析的細菌中，轉化可以作為一種研究的手段。

蛋白質

轉染是轉化的一種特殊形式，是用除去蛋白質外殼的病毒（包括噬菌體）核酸感染細胞或原生質體的過程。與一般的轉化過程的區別在于：①轉染過程中進入細胞的是完整的病毒DNA，而通過轉化進入受體細胞的則是染色體DNA的片斷或質粒DNA；②轉染過程中病毒DNA一般不整合到染色體上，但轉化過程則往往涉及DNA的整合；③轉染效果可用單位量的DNA引起的病斑或噬菌斑的多少來表示，轉化效果則用一定量的DNA所帶來的被轉化的受體細胞菌落數目來表示。

3大腸桿菌轉化

實驗材料準備

1. 器材

旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5 ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴（或恒溫水浴鍋），制冰機，恒溫搖床，培養皿（已鋪好固體LB-Amp），超凈工作臺，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養箱。

2. 試劑

培養基（不加抗菌素），LB培養基（加抗菌素），無菌ddH2O，IPTG，X-gal。

3. 材料處理

無菌ddH2O，1.5 ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

操作步驟

1. 事先將恒溫水浴的溫度調到42℃。

2. 從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管（100 μl）感受態菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

3. 加入5 μl 連接好的質粒混合液（DNA含量不超過100 ng），輕輕震蕩后放置冰上20 min。

4. 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2 min進行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5

min。

5. 在超凈工作臺中向上述各管中分別加入500 μl LB培養基（不含抗菌素）輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1 h。

6. 在超凈工作臺中取上述轉化混合液100-300 μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

7. 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2%

X-gal，8 μl 20% IPTG，用酒精燈燒過的玻璃涂布棒涂布均勻。

8. 在涂好的培養皿上做上標記，先放置在37℃恒溫培養箱中30~60 min 直到表面的液體都滲透到培養基里后，再倒置過來放入37℃恒溫培養箱過夜。

9. 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫實驗報告。

10. 觀察平板上長出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。[1]

4真核生物的轉化

在酵母菌、脈孢菌和植物細胞中轉化的主要障礙是細胞壁。把細胞壁用酶消化后便能有效地轉化。高等動物細胞的轉化大多是在離體培養細胞中發現的，例如小鼠細胞、雞胚細胞和人的海拉細胞等，這些細胞常以胞飲方式攝取物質。使供體DNA形成磷酸鈣沉淀能顯著地提高轉化效率。由于高等動植物細胞的轉化頻率遠遠低于細菌，因此一個轉化實驗能否成功在很大程度上取決于選擇性培養基和選擇性標記的恰當使用。例如在一個哺乳動物細胞的轉化系統中，用取自皰疹病毒（HSV）的胸腺嘧啶核苷激酶（TK）基因DNA去轉化相應的缺陷型細胞TK-，并用HAT培養基來篩選有TK+基因標記的轉化細胞便能成功（見體細胞遺傳學）。在同一轉化系統中，如果把大量沒有選擇性標記的DNA混合少量有TK基因選擇標記的DNA去轉化TK-細胞，這樣得到的TK+細胞中將有一小部分也為無選擇性標記的DNA所轉化，這種現象稱為共轉化。 在高等動物中雖然現在還不能進行活體的轉化，但可以把轉化細胞注射到活體中，使它們取代活體中未轉化的細胞。例如可以用抗氨甲蝶吟的小鼠細胞株的DNA片段轉化體外培養的小鼠骨髓細胞（這些細胞有特定的染色體標記，易于與受體小鼠的骨髓細胞相區別），然后把轉化的骨髓細胞注入受體小鼠的骨髓。在一段時間后這些小鼠的骨髓中可以檢出抗氨甲蝶呤的細胞。如果為接受注射的小鼠經常注射氨甲蝶呤，隨著飼養時間的推移可以看到帶有特定染色體標記的細胞的百分數逐漸增加，此種情況說明抗氨甲蝶呤的細胞經過細胞分裂增殖而部分地取代了未轉化的細胞。這樣的工作顯然是向基因治療這一目標跨出的第一步。在高等植物中某些體細胞能在一定的培養條件下生長成完整的植株，因此便有可能通過轉化培養細胞培育成不同基因型的新種植株。

在真核生物的細胞生物學研究中，轉化這一名詞還有另一種意義，這就是由致癌的RNA或DNA病毒感染真核細胞引起的細胞癌變現象。進入細胞的病毒基因組DNA往往整合到被轉化的細胞的染色體上。為了明確起見，這種轉化有時又稱為細胞轉化。

二、轉染

轉染(transfection)指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程。常規轉染技術可分為瞬時轉染和穩定轉染（永久轉染）兩大類。

1簡介

轉染(transfection)指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程。

常規轉染技術可分為兩大類，一類是瞬時轉染，一類是穩定轉染（永久轉染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達，但通常只持續幾天，多用于啟動子和其它調控元件的分析。一般來說，超螺旋質粒DNA轉染效率較高，在轉染后24-72小時內（依賴于各種不同的構建）分析結果，常常用到一些報告系統如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩定轉染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉染細胞能整合，通常需要通過一些選擇性標記，如來氨丙基轉移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復篩選，得到穩定轉染的同源細胞系。

轉染技術的選擇對轉染結果影響也很大，許多轉染方法需要優化DNA與轉染試劑比例，細胞數量，培養及檢測時間等。

2分類

化學

包括：-葡聚糖法，2.磷酸鈣法，3.人工脂質體法。DEAE-葡聚糖是最早應用哺乳動物細胞轉染試劑之一，DEAE-葡聚糖是陽離子多聚物，它與帶負電的核酸結合后接近細胞膜而被攝取，用DEAE-葡聚糖轉染

成功地應用于瞬時表達的研究，但用于穩定轉染卻不是十分可靠。磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉染法，因為試劑易取得，價格便宜而被廣泛用于瞬時轉染和穩定轉染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養的細胞上，通過細胞胞膜的內吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細胞內的核酸酶活性而保護外源DNA免受降解.人工脂質體法采用陽離子脂質體，具有較高的轉染效率，不但可以轉染其他化學方法不易轉染的細胞系，而且還能轉染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質.此外，脂質體體外轉染同時適用于瞬時表達和穩定表達，與以往不同的是脂質體還可以介導DNA和RNA轉入動物和人的體內用于基因治療。人工合成的陽離子脂質體和帶負電荷的核酸結合后形成復合物，當復合物接近細胞膜時被內吞成為內體進入細胞質，隨后DNA復合物被釋放進入細胞核內，至于DNA是如何穿過核膜的，其機理目前還不十分清楚.

物理

包括：①顯微注射②電穿孔③基因槍等，顯微注射雖然費力，但是非常有效的將核酸導入細胞或細胞核的方法。這種方法常用來制備轉基因動物，但卻不適用于需要大量轉染細胞的研究。電穿孔法常用來轉染如植物原生質體這樣的常規方法不容易轉染的細胞。電穿孔靠脈沖電流在細胞膜上打孔而將核酸導入細胞內。導入的效率與脈沖的強度和持續時間有關系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導入細胞內，這種方法適用于培養的細胞核在體的細胞.

3實驗

細胞轉染實驗

目的

學習和掌握外源基因導入真核細胞的主要方法—脂質體介導的轉染。了解外源基因進入的一般性方法，觀測外源蛋白的表達（綠色熒光蛋白），為染色準備實驗材料。

原理

外源基因進入細胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質體介導法和病毒介導法。電擊法是在細胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質粒進入；磷酸鈣法和脂質體法是利用不同的載體物質攜帶質粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進入細胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細胞的方法使得其進入細胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴、難度較大；病毒法的前期準備較復雜、而且可能對于細胞有較大影響；所以現在對于很多普通細胞系，一般的瞬時轉染方法多采用脂質體法。

利用脂質體轉染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質體與質粒的比例，細胞密度以及轉染的時間長短和培養基中血清的含量都是影響轉染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉染條件對于效率的提高有巨大的作用。

本次實驗采用的脂質體是promega公司的TransFast脂質體試劑，它是一種陽離子脂質體和中性脂質體的混合物，是對于本次實驗中采用的293T細胞優化的轉染試劑。"

材料器材

（1）材料

293T細胞、MyoD表達質粒和EGFP表達質粒、DMEM培養基、鏈霉素/青霉素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑（TransFast）

（2）器材

20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計數板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺式離心機、35mm培養皿、轉染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD

步驟

細胞傳代

(1)試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養皿，離心管。

(2)棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。 (3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘（37C，5%CO2)。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。

(4)加入1ml的含血清培養基終止反應。

(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。

(6)將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。

(7)用培養液重懸細胞，細胞計數后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。

(8)將合適體積完全培養液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。

(9)將培養皿轉入CO2培養箱中培養，第二天轉染。

細胞轉染

1）轉染試劑的準備

A.將400ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。

2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量）來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉染試劑，再次震蕩。

5）將混合液在室溫放置10—15分鐘。

6)吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。

7）加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。

8）到時后，根據細胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養基繼續培養24－48小時。

第二次細胞傳代

1） 在轉染后24小時，觀察實驗結果并記錄綠色熒光蛋白表達情況。

2） 再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新放入培養皿中。

3） 在正常條件下培養24小時后按照染色要求條件固定。

。4篩選

轉染細胞篩選

1．確定抗生素作用的最佳濃度：

不同的細胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預試驗，確定抗生素對所選擇細胞的最低作用濃度。

1) 提前24 小時在96 孔板或24 孔板中接種細胞8 孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養過夜。

2) 將培養液換成含抗生素的培養基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400,

600, 800 和1000μg/ml）。

3) 培養10-14 天以絕大部分細胞死亡濃度為準,一般為400-800μg/ml,篩選穩定表達克隆時可比該濃度適當提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半.

2．轉染按前面的步驟進行。

3．轉染72 小時后按1:10 的比例將轉染細胞在6 孔板中傳代，換為含預試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養基。在6 孔板內可見單個細胞，繼續培養可見單個細胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。

1) 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過胰酶,將濾紙片貼在單細胞集落上10-15

秒，取出粘附有細胞的濾紙片放于24 孔板中繼續加壓培養。細胞在24 孔板中長滿后轉入25cm 培養瓶中,長滿后再轉入75cm 培養瓶中培養。 2) 有限稀釋法：將細胞消化下來后做連續的10 倍稀釋（10-2—10-10），將每一稀釋度的細胞滴加到96 孔板中培養，7-10 天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進行克隆。

4. ELISA 或Western blot 檢測單克隆細胞中外源蛋白的表達情況由于不同克隆的表達水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達量最高的克隆傳代并保種。[1]

5研究進展

轉染技術

國際上推出了一些陽離子聚合物基因轉染技術，以其適用宿主范圍廣，操作簡便，對細胞毒性小，轉染效

率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）的轉染性能最佳，但樹枝狀聚合物的結構不易于進一步改性，且其合成工藝復雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機大分子，每相隔二個碳個原子，即每“第三個原子都是質子化的氨基氮原子，使得聚合物網絡在任何pH下都能充當有效的“質子海綿”(protonsponge)體。這種聚陽離子能將各種報告基因轉入各種種屬細胞，其效果好于脂質聚酰胺，經進一步的改性后，其轉染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細胞毒性低。大量實驗證明，PEI是非常有希望的基因治療載體。目前在設計更復雜的基因載體時，PEI經常做為核心組成成分。

轉染效率

線型PEI（LinePEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉染載體的研究比分枝狀PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，過去的研究認為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉染復合物的細胞毒性較低，有利于細胞定位，因此與BPEI相比應該轉染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉染復合物，從而提高轉染效率，但同時細胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發現這種PEI的毒性低，但轉染效率卻較高。

GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯劑交聯，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結構使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質粒形成小的納米顆粒，從而提高轉染效率，當所形成復合物進入細胞以后，其中所含的生理條件下可降解的化學鍵在細胞內水解，使交聯聚合物分解為無細胞毒性的小分子PEI，這樣結構的轉染試劑在體外應用可以獲得高的轉染效率和低的細胞毒性，其可降解性對體內應用也具有重要的意義。

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