牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備

2024年3月6日發(fā)(作者：蔞蒿滿地)

實驗三 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備、微生物的分離與純化

實驗目的：掌握培養(yǎng)基的配制原則與方法；

掌握劃線分離純化微生物的原理與方法

熟悉手提式高壓滅菌器的使用方法和注意事項；

實驗材料：器材：試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋等。

試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂等

實驗原理：

培養(yǎng)基是人工按一定比例配制的供微生物生長繁殖和合成代謝產物所需要的營養(yǎng)物質的混合物。培養(yǎng)基的原材料可分為碳源、氮源、無機鹽、生長因素、能源和水。根據微生物的種類和實驗目的不同，培養(yǎng)基要選擇合適的配比關系；選擇合適的理化性質；配后要及時滅菌。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這種培養(yǎng)基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質，所以可供細菌生長繁殖之用。

高壓蒸汽滅菌方法主要是通過升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。

從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的分離、純化方法：單細胞挑取法，稀釋涂布平板法，稀釋混合平板法，平板劃線法等

實驗內容：

1.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備

（1）計算 根據配方計算出實驗中各種藥品所需要的量，然后再分別稱量。

（2）稱量 準確稱取各種成分。一些不易稱量的成分如牛肉膏，可用玻璃棒取出放硫酸紙上稱量，然后連同硫酸紙一起放入燒杯中。

（3）溶解 向燒杯內加入所需的水量，將牛肉膏用水洗下后，取出硫酸紙棄去。加熱攪拌全溶后稍放冷。

（4）調pH值 用酸度計或精密pH試紙測定其pH值，并用10％NaOH調

至所需pH值，必要時用濾紙或脫脂棉過濾。一般比要求的pH高出0.2，因為高壓蒸汽滅菌后，pH常降低。

（5）分裝 根據不同需要，可將配好的培養(yǎng)基分裝入配有棉塞的試管或三角瓶內（附圖1-1）。注意分裝時避免培養(yǎng)基掛在瓶口或管口上引起雜菌污染。如液體培養(yǎng)基，應裝試管高度的1/4左右；固體培養(yǎng)基裝試管高度的1/5左右；裝入三角瓶的量以三角瓶容量的一半為限。

（6）包扎 試管扎成捆。試管和三角瓶的棉塞外用硫酸紙和牛皮紙包扎，紙上表明培養(yǎng)基的名稱、配制日期等。

（7）滅菌 培養(yǎng)基用0.1Mpa（15lb/in2）高壓蒸汽滅菌15~20min，

2.培養(yǎng)基的高壓蒸汽滅菌

滅菌原理：水的沸點可隨壓力的增加而提高，當高壓蒸汽滅菌鍋中水煮沸時，因鍋是密閉的，蒸汽不能溢出，而使壓力增加，水的沸點和溫度也隨之增加。因此，高壓蒸汽滅菌是利用高壓蒸汽產生的高溫，以及熱蒸汽的穿透能力來達到滅菌的目的。一般在0.1Mpa（15lb/in2）的壓力時，溫度可達121℃只要維持15~20min，就可殺死一切微生物的營養(yǎng)體和它們的各種孢子。

滅菌方法：

(1) 加水于滅菌器內到規(guī)定的水平面。

(2) 需滅菌的物品（分裝在試管、三角燒瓶中的固、液體培養(yǎng)基），棉塞、硅膠泡沫塞等用防潮紙包好（防止鍋內水汽把棉塞淋濕），放入滅菌鍋內的套筒中。擺放要疏松，不可太擠，否則阻礙蒸汽流通，影響滅菌效果。

(3) 將滅菌鍋蓋的排氣管插人套筒側壁的凹槽內，關閉滅菌鍋蓋旋緊螺栓，切勿漏氣。

(4) 打開放氣閥，加熱，熱蒸汽上升，以排除鍋內冷空氣，排氣約5~ l0min，關閉放氣閥。

(5) 關閉放氣閥后，整個滅菌鍋成為密閉狀態(tài)，而蒸汽又不斷增多，這時壓力和溫度都上升，直至壓力表指針達到所需壓力時，開始計時，通過調節(jié)熱源，維持此壓力到所需時間。

(6) 滅菌完畢，待壓力自然降至0時，打開放氣閥，注意不能打開過早，否

則突然降壓致使培養(yǎng)基沖騰，使棉塞、硅膠泡沫塞沾污，甚至沖出容器以外。

(7) 打開滅菌鍋蓋，取出已滅菌的器皿及培養(yǎng)基。

(8) 滅菌鍋用完后，將鍋內剩余的水倒掉，以免日久腐蝕。

3.微生物的分離與純化

借助于劃線將混雜的細菌材料逐步稀釋，最后在瓊脂平板上分散開來，使之出現單一菌落而達到分離純化的目的。

4. 注意事項

1.要嚴格按配方配制。

2.調pH不要過頭。

3.高壓滅菌要注意物品不要過多，加熱后排除冷空氣，到時降壓回零取物。

4. 劃線法分離純化微生物注意各區(qū)勿相互交叉。

5. 示教內容：

微生物的分離純化