中國組織工程研究與臨床康復 第15卷 第12期 2011–03–19出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Rearch March 19, 2011 Vol.15, No.12
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
2095Third Department of Orthopaedics, Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, Anhui Province, China
Tang Jian, Chief physician, Third Department of
Orthopaedics, Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, Anhui Province, China tangjian_ayfy@ 163
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No.
30772440*; Scientific and Technological Project of Anhui Province, No. 08010302196*
Received: 2010-09-20
Accepted: 2010-10-20
安徽醫科大學附屬第三醫院骨三科，安徽省合肥市 230022
湯健，男，1958年生，安徽省巢湖市人，漢族，1982年安徽醫科大學畢業，主任醫師，主要從事骨科
臨床及骨修復材料研究。
tangjian_ayfy@ 163
中圖分類號:R318 文獻標識碼:B
文章編號:1673-8225 (2011)12-02095-05
收稿日期：2010-09-20 修回日期：2010-10-20
(20100920015/D?Y)
肝素-殼聚糖復合體-羥基磷灰石-米諾環素新型仿生納米復合材料 修復兔脛骨缺損**
湯 健，李全利，周 劍，竇曉晨
New bionic composite of heparin-chitosan-hydroxyapatite-minocycline repairs rabbit tibial defects
T ang Jian, Li Quan-li, Zhou Jian, Dou Xiao-chen Abstract
Tang J, Li QL, Zhou J, Dou XC.New bionic composite of heparin-chitosan-hydroxyapatite-minocyclin
e repairs rabbit tibial defects. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2011;15(12):2095-2099. [ en.zglckf]
摘要
湯健，李全利，周劍，竇曉晨.肝素-殼聚糖復合體-羥基磷灰石-米諾環素新型仿生納米復合材料修復兔脛骨缺損[J].中國組織工程研究與臨床康復，2011，15(12):2095-2099. [ cn.zglckf]
0 引言
由于創傷、感染、腫瘤等形成骨缺損，當缺損超過人體自修復能力僅以纖維組織充填導致骨缺損不愈合，形成骨不連。骨缺損的治療是骨科的難題之一。目前臨床上的植骨主要有自體骨、異體骨、人工骨等。自體骨移植包括游離骨移植和帶血管骨移植，從修復質量，免疫排斥，
疾病傳播等多方面綜合評定，是臨床治療骨缺損的金標準。但自體骨移植存在著取骨量有限，對患者有二次創傷，增加患者痛苦，影響供骨區生物力學強度和功能等缺點[1]。異體骨分為同種異體骨和異種異體骨，雖然具有自體骨的組織學特點，并可以減少手術次數，但存在著一定的免疫排斥反應以及潛在感染的病毒感染風險，且由于目前工藝水平及來源限制，制樣、處理、存儲的成本很高，價格昂貴，應用受到限制，無法在臨
湯健，等. 肝素-殼聚糖復合體-羥基磷灰石-米諾環素新型仿生納米復合材料修復兔脛骨缺損
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床大規模使用。為了克服自體骨移植和異體骨移植的缺點，利用人工修復材料進行骨缺損修復開始成為治療骨缺損研究中的熱點。
近20年來，應用分子仿生方法構建有機-無機復合的骨組織修復材料是人體硬組織修復材料研究的熱點之一[2-3]。生物礦化組織的無機相具有種類的特異性，但是都是從有機大分子產生、合成、并受大分子的控制，既“生物礦化有機基質調控理論”，其不是以組織替代為目的，而是促進組織的再生；具有生物活性以及促進組織自我修復的能力；一旦植入體內，就能在分子水平激活基因表達，刺激特異性的細胞反應，幫助機體進行自我修復[4]
。
合作單位四川大學華西口腔實驗室以肝素-殼聚糖復合物為大分子模板，調控羥基磷灰石的生長，同時裝載抗菌藥物米諾環素合成新型抗菌納米復合骨修復材料。實驗通過制作兔脛骨臨界性骨缺損動物模型來評價這種新型硬組織修復材料促進骨缺損修復的效果。
1 材料和方法
設計：隨機對照動物實驗。
時間及地點：實驗于2009-10/2010-03在安徽醫科大學動物實驗中心完成。
材料：
實驗動物：健康新西蘭大白兔20只，兔齡五六個月。
體質量2.5~3.5 kg ，雌雄不拘，購于安徽醫科大學動物實驗中心(合格
證號：皖醫實動準字02號)。
實驗過程中對動物的處置符合中華人民共和國科學技術部2006年頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》標準。
主要試劑及儀器：
方法：
材料的制備：合作單位四川大學華西口腔實驗室以肝
素-殼聚糖復合體為大分子模板，調控羥基磷灰石的生長，同時裝載抗菌藥物米諾環素合成新型抗菌納米復合骨修復材料。
動物模型制備及分組處理：制備兔的脛骨上端腔隙
性骨缺損模型[5]。3%戊巴比妥鈉按1 mg/kg 行耳緣靜脈
注射麻醉，固定四肢，剪除雙膝以下小腿的兔毛。碘伏消毒，鋪洞巾。以膝關節以下脛骨內髁的平臺為基點，做一縱行切口，約3 cm 。分離軟組織，仔細剪除內髁平臺周圍骨膜，用口腔科磨鉆切除脛骨內髁的平臺關節面以近皮質骨約1.5 cm×0.8 cm 大小，刮匙刮除骨髓及松質骨。沖洗后，仔細止血。20只大白兔隨機數字表法分為實驗組(n =16)和空白對照組(n =4)。實驗組填塞實驗材料，壓緊填實；空白對照組只造骨缺損模型，未做處理。全層縫合皮膚，外用手術切口敷料包裹切口。術后未予以固定，籠養，常規飼養。
主要觀察指標：
X 射線平片檢查：于術后2，4，8，12 周拍片，攝片
后處死。觀察骨缺損愈合情況，骨痂密度等，條件為 0.4 s ，50 mA ，40 kV 。
病理切片：取下來的骨缺損樣本甲醛固定：①甲酸常
規脫鈣石蠟包埋，切片蘇木精-伊紅染色。②制作硬組織學切片，Masson 染色，Olympus 光學顯微鏡觀察觀察骨缺損區組織形態學變化。
大體觀察：觀察實驗動物的一般表現，上肢術后切口
愈合情況，肢體活動，處死后觀察骨折端與材料界面及軟組織界面的情況，植入區的材料顏色以及體積變化，缺損區骨質生長情況，炎癥反應情況等。
2 結果
2.1 實驗動物數量分析 在實驗之前做過多次預實驗，對兔的習性，麻醉劑量，術中操作，手術時間，術中補液，術后護理，等均做出了精細安排，有效減少了動物的出血量和麻醉時間，因此在后期的手術過程中均無動物的非實驗要求死亡。
術后20 min ，實驗動物完全蘇醒，能自由活動。
術后前3 d 進食較少，活動逐漸好轉，術后1 d 觀察切開周圍組織輕微腫脹，淤血。切開無紅腫、滲液、流膿等炎癥反應。皮膚無膿腫形成。通過改進實驗條件和術后飼養水平，以及合理改進實驗時間，家兔均成活至實驗要求時間。 2.2 大體觀察
試劑及儀器
來源
溶液沉淀合成、非燒結 羥基磷灰石粉末(微米級) 四川大學口腔醫學院
材料研究室 殼聚糖，肝素 Sigma 公司 鹽酸米諾環素(純度99%) 武漢遠城科技發展有限公司顯微鏡 Olympus bx51 pixellink 微型直流高速調速電鉆套裝 Revolution XR/d X 光機 韓國STRONG 204系列 美國GE 公司 Leica 病理組織包埋機，Leica SP1600硬組織切片機 德國Leica 公司
湯健，等. 肝素-殼聚糖復合體-羥基磷灰石-米諾環素新型仿生納米復合材料修復兔脛骨缺損
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空白對照組12周：軟組織增生充填覆蓋骨缺損，未形
成骨性愈合。標本剖面見骨缺損髓腔形成空腔，髓腔兩端封閉，未有新生骨長入。 2.3 修復后X 射線平片檢查
兩組修復后X 射線檢查結果：
2.4 組織學觀察 實驗組植入2周蘇木精-伊紅染色，成骨細胞包繞著大量的骨髓基質細胞形成，無明顯的炎癥反應。成骨活躍。植入材料正在分解。見圖3。
修復4周后，新骨形成明顯增多。大量的網狀編織骨形成。形成骨島，鈣化明顯增強，開始早期塑形改變，
可見骨細胞形成的腔隙及新骨周邊有破骨細胞，見圖4。
第8周，編織樣骨組織進一步成熟，趨于有序性。纖維的排列方向表現出負荷的適應性改建，髓腔已經漸漸形成，骨小梁上可見成熟骨細胞，材料已分解，見圖5。
在12周時，新生骨組織進一步成熟，表現為松質骨逐漸向密質骨的改建，出現板層骨結構，可見小血管。骨創邊緣與原有正常骨組織相接，表現成骨的連續性，見圖6。
空白對照組12周時觀察見髓腔無明顯成骨現象，大量纖維組織及炎癥細胞浸潤，骨折斷端未愈合。 2.5 硬組織學切片 4周時觀察骨折斷端有新骨骨折斷端未融合，接觸區材料分解較完全，大量網狀編制骨形成，開始早期塑形。高倍鏡下見新生骨基質中骨細胞
Figure 1 Bone defects area after experimental group animals were killed
圖1 實驗組處死后骨缺損區觀察
Figure 3 Decalcified
ctions at 2 wk postoperation (Hematoxylin-eosin staining)
圖3 蘇木精-伊紅染色觀察材料植入2周脫鈣切片 a: Postoperative 2 wk c: Postoperative 8 wk b: Postoperative 4 wk
Figure 2 X ray films of repairing bone defect at different time
in the experimental group
圖2 實驗組骨缺損不同時期的X 射線平片 Figure 4 Decalcified ctions at 4 wk postoperation
(Hematoxylin-eosin staining)
圖4 蘇木精-伊紅染色觀察材料植入4周脫鈣切片
Figure 5 Decalcified ctions at 8 wk postoperation (Hematoxylin-eosin staining)
圖5 蘇木精-伊紅染色觀察材料植入8周脫鈣切片
d: Postoperative 12 wk
a: Postoperative 2 wk c: Postoperative 8 wk b: Postoperative 4 wk d: Postoperative 12 wk a: ×40
b: ×100 OB
NB a: ×40 b: ×100 M NB M
NB OB
NB C NB: new bone; OB: osteoblasts; M: repairing material; C: osteocytes
NB: new bone; OB: osteoblasts; M: repairing material
a: ×40 b: ×100 NB C NB: new bone; C: osteocyte; MC: marrow cavity; F: fibrous connective tissue MC F
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形成，周圍有成骨細胞包繞，見圖7。
12周時觀察顯示骨折斷端與新生骨融合，邊界已難分清，表現出骨的連續性，見圖8。
3 討論
Hollinger 等[6]將臨界性骨缺損規定為在動物生命周期內愈合小于10%的骨缺損，如果1年內未達此水平，便可以認為此模型符合CSD 的標準這具有一般的指導性。
李翼等[7]證明了兔的脛骨上端腔隙性骨缺損模型的有效性。本次實驗所形成的缺損遠超過此臨界值的需求，在實驗中空白對照組也顯示12周時骨缺損區無骨性愈合，表明實驗設計的缺損模型是一種骨創不能自行愈合的骨缺損模型。
植入后不同時間點的大體觀察攝片證明，隨著時間推移，實驗組每個時間點植入材料顏色較之前都變
淡，材料分解明顯，新生骨痂與周圍骨組織界限已經模糊，到12周時缺損已經不能看到，骨缺損區已骨性愈合，外有少量纖維組織包裹，未見纖維組織長入，有血管孔生成。
植入后不同時間點的X 射線平片證明，實驗組每個時間點都有骨痂形成，骨缺損區形成毛玻璃樣模糊影，且隨著時間的推移，骨缺損區的邊界越模糊，到12周時缺損已經不能看到，符合大體觀察標本所看到的情況。而空白對照組骨缺損區12周時周圍骨皮質硬化，缺損清晰，表明未有新生骨形成，骨缺損未得到有效修復。
組織學觀察術后不同時期染色切片，隨著時間的推移，骨折斷端成骨活躍，新生骨基質周圍包繞著大量成骨細胞，到4周后骨折端新骨形成明顯增多。大量的網狀編織骨形成，鈣化較強，有成骨細胞包埋在骨陷窩中成為骨細胞，術后8周時實驗組顯示編織樣骨組織進一步成熟，骨小梁趨于有序性，松質骨逐漸向密質骨的改建，出現板層骨結構。可見小血管，骨創邊緣與原有正常骨組織相接，表現成骨的連續性，表明新型骨修復材料可以有效修復骨缺損。
實驗從大體觀察、影像學及組織學三方面證明了新型骨修復材料可以有效修復骨缺損，其機制可能是：骨組織是由24%的有機成分和74%的無機成分組成，無機成分則主要是羥基磷灰石的納米級晶體。新型復合材料中羥基磷灰石以納米級纖維填充無機基質，具有天然骨的類似結構。充分發揮納米羥基磷灰石的生物相容性，而由肝素和殼聚糖復合體組成有機基質模板，調控羥基磷灰石晶體的生長。
殼聚糖是一種天然多糖，具備良好的生物相容性，一定的孔徑和孔隙率利于細胞長入，較好的生物機械性，降解性等
[8-11]
。可作為仿生合成人工材料的大分子模板，
已被廣泛應用于生物材料和生物制藥領域。以殼聚糖制成的納米載體可延長藥物在吸收部位的保留時間，達到緩釋控釋的效果[12-15]。肝素是一種天然生物活性多糖類化合物，除具有很強的抗凝血性外，肝素分子中含有與多種生長因子結合的位點，能夠促進生長因子對細胞增殖、組織或器官修復和再生的作用。研究表明，控釋載體肝素化是制備生物載體的有效方法[16-17]。采用殼聚糖結合肝素分子形成的生長因子載體可有效減低生長因子的擴散速率，并可有效保護其活性[18]。裝載的抗菌成分米諾環素，是四環素類藥物，具有抗菌、抑制膠原酶、抑制骨吸收、易于新骨形成等作用[19-20]。米諾環素本身是一種金屬螯合劑，能夠與Ca 2+等陽離子絡合。因此在反應的過程中，米諾環素
Figure 6 Decalcified ctions at 12 wk postoperation
(Hematoxylin-eosin staining)
圖6 蘇木精-伊紅染色觀察材料植入12周脫鈣切片
Figure 7 Histological ctions of broken ends at 4 wk postoperation in the experimental group (Masson
staining)
圖7 實驗組4周斷端硬組織學切片(Masson 染色) Figure 8 Histological ctions of broken ends at 12 wk postoperation in the experimental group (Masson staining) 圖8 實驗組12周斷端硬組織學切片(Masson 染色) a: ×40
b: ×100 NB: new bone; OB: osteoblasts; M: repairing material; C: osteocyte; BV: bone vesl
a: ×40 b: ×200 NB: new bone; OB: osteoblasts; M: repairing material; C: osteocyte; B: bone tissue a: ×40 b: ×100 NB: new bone; MC: marrow cavity BV
NB
MC
MC
C
F
MB
MC
NB
B NB OB C
M
NB
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與Ca 2+的絡合，一方面，影響了磷灰石的晶體結構，使磷灰石晶體含有Cl 等元素
[21-22]
；另一方面，米諾環素分子也
被包裹在羥基磷灰石晶體、殼聚糖及肝素分子中，能夠持續、穩定、高效的緩慢釋放。體外實驗已經證明復合物中，米諾環素可以不斷的緩釋，發揮抗菌作用。
肝素-殼聚糖復合體-羥基磷灰石-米諾環素仿生納米復合材料修復兔脛骨缺損的實驗研究證明其可以有效促進臨界性骨缺損的修復，為此新型材料的臨床應用打下了基礎。
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