[19]
中華人民共和國國家知識產(chǎn)權(quán)局
[12]發(fā)明專利申請公布說明書
[11]公開號CN 101419140A [43]公開日2009年4月29日
[21]申請?zhí)?00810162190.1[22]申請日2008.11.18
[21]申請?zhí)?00810162190.1
[71]申請人浙江理工大學(xué)
地址310018浙江省杭州市江干區(qū)經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)
區(qū)白楊街道2號大街5號
[72]發(fā)明人蔡玉榮 姚菊明 李恭楚 王秀華 [74]專利代理機構(gòu)杭州求是專利事務(wù)所有限公司代理人林懷禹
[51]Int.CI.G01N 1/28 (2006.01)G01N 21/64 (2006.01)A61B 5/00 (2006.01)
權(quán)利要求書 1 頁 說明書 6 頁 附圖 3 頁
[54]發(fā)明名稱
一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法
[57]摘要
本發(fā)明公開了一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記
的方法。該方法是將生物熒光素-異硫氰酸熒光素
通過吸附或共價鍵等方法連接到羥基磷灰石顆粒上，
使羥基磷灰石顆粒被標(biāo)記上熒光。本發(fā)明采用的標(biāo)
記物異硫氰酸熒光素，是一種生物熒光素，具有較
好的生物相容性；經(jīng)過長時間反應(yīng)和充分洗滌之后，
異硫氰酸熒光素可以與羥基磷灰石顆粒實現(xiàn)牢固結(jié)
合，使用過程中不會從羥基磷灰石表面脫離下來對
試驗結(jié)果造成負(fù)面影響；所得到的熒光物質(zhì)吸收峰
范圍較窄，為480～510納米之間，適用于多種熒光
同時存在的環(huán)境中。本發(fā)明可應(yīng)用于材料和生物醫(yī)
學(xué)研究領(lǐng)域，尤其適用于羥基磷灰石顆粒與細(xì)胞相
互作用時的界面、過程及機理研究。
200810162190.1權(quán) 利 要 求 書第1/1頁 1.一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，其特征在于：配制重量百分比為1.5～3％的重碳酸鈉緩沖溶液，將異硫氰酸熒光素溶解在該緩沖溶液中，控制異硫氰酸熒光素在緩沖溶液中的濃度為0.02～0.1克每升；再將羥基磷灰石顆粒分散在上述溶液中，顆粒濃度為0.5～1.5克每升，攪拌0.5～2小時；利用羥基磷灰石的強吸附作用將異硫氰酸熒光素吸附到顆粒表面，再將該懸濁液避光環(huán)境保存在1～8℃下繼續(xù)作用10～20小時后，通過離心、透析和過濾作用除去顆粒表面未吸附的熒光素；將標(biāo)記好的羥基磷灰石顆粒在35～45℃避光環(huán)境中真空干燥，得到干燥的熒光標(biāo)記的羥基磷灰石顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，其特征在于：所述熒光標(biāo)記的羥基磷灰石顆粒在溫度為110～125℃，壓力為104-108kPa，在15～20min下進(jìn)行滅菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，其特征在于：所述熒光標(biāo)記的羥基磷灰石的最大吸收波長為490納米，最大發(fā)射波長為503納米。
200810162190.1說 明 書第1/6頁
一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法。
背景技術(shù)
自然界中，脊椎動物硬組織的主要生物礦物相是羥基磷灰石。研究發(fā)現(xiàn)，人工合成的羥基磷灰石具有與礦物相羥基磷灰石相同的成分、結(jié)構(gòu)和優(yōu)秀的生物相容性，因此被認(rèn)為是最理想的骨組織修復(fù)替代材料之一，在臨床上已被廣泛用于骨組織缺失和缺損的修復(fù)和替代。
近年來，隨著分析檢測方法和技術(shù)的飛速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)構(gòu)成人體硬組織的羥基磷灰石顆粒的基本構(gòu)成單元都保持在納米尺度—有序的羥基磷灰石顆粒鑲嵌在膠原蛋白中，賦予了骨組織優(yōu)秀的生物學(xué)和力學(xué)性能“G a o H.，J i B.，J a g e r I. L.，A r z t E.，F(xiàn) r a t z P.，P N A S，2003，100，5597；C u r r y J.D.，P r o c.R.S o c.L o n d. B，1997，196，443”。生物礦化及仿生材料研究使得人們將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了納米羥基磷灰石。目前認(rèn)為人體內(nèi)鈣化過程是在正確時間、正確地點，生成和維持正確量和正確結(jié)構(gòu)的礦化產(chǎn)物“王夔，化學(xué)通報，2003，15，428；楊曉達(dá)，張?zhí)焖{(lán)，王夔，化學(xué)進(jìn)展，2004，16，836”，在此過程中，細(xì)胞和有機基質(zhì)起到了重要的調(diào)控作用，但是其調(diào)控機理卻知之甚少。此外，作為一種新型的生物醫(yī)用材料，人們更多關(guān)注的是納米羥基磷灰石的生物相容性。目前比較一致的結(jié)論是納米羥基磷灰石能夠抑制腫瘤細(xì)胞和癌細(xì)胞的增殖和分化“F u Q，Z h o u N，H u a n g W，W a n g D，Z h a n g L，L i H.，J B i o m e d.M a t e r.R e s.(A)2005，74A 156；W a n g Y.，Yan Y.H.，Li Sh.P.，J Wuhan Univ.Tech.(mater.Scien.Edition)2005，20，184”，但對于普通細(xì)胞的影響則具有多樣性。相關(guān)的研究工作還有很多“T h o m a s J.W.，Celaletdin E.，Robert H.D.，Rochard W.S.，Biomaterials 2000，21，1803；Sun J.，Lin F.，Hung T.，Tsuang Y.，Chang W.，Liu H.，J.Biomed.Mater.Res.1999，311；Welzel T.，Radtke I.，Meyer-Zaika W.，Heumannb R.，Epple M.J Mater.Chem.
2004，14，2213.”。磷酸鈣這種特殊的細(xì)胞生物相容性以及近來在用作非病毒基因/藥物載體以及齲齒
修復(fù)和牙小管填充等方面表現(xiàn)出來的潛能使得人們對其在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用寄予厚望。但是關(guān)于磷酸鈣與細(xì)胞作用的機理研究卻剛剛起步，很多疑問還亟待回答，例如磷酸鈣是在哪個位置上對細(xì)胞產(chǎn)生影響，細(xì)胞膜上還是細(xì)胞內(nèi)？它的哪些特征是影響細(xì)胞的關(guān)鍵因素？它通過哪些途徑實現(xiàn)
對細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響？是否可以通過人為改變磷酸鈣的物化性能來調(diào)控細(xì)胞的行為？這些問題的解決對于我們了解生物礦物礦化機理和設(shè)計開發(fā)新型醫(yī)用材料以及制定安全性評價標(biāo)準(zhǔn)都有著深遠(yuǎn)且現(xiàn)實的意義。
進(jìn)行納米羥基磷灰石的生物相容性、礦化機理以及與細(xì)胞相互作用的研究時，我們首先遇到的一個問題是如何對該種材料進(jìn)行示蹤。解決這個問題最有效的辦法是對該材料進(jìn)行生物標(biāo)記。例如，將近紅外熒光量子點與羥基磷灰石復(fù)合“儲茂泉，金鑫，發(fā)明專利，近紅外熒光量子點標(biāo)記的羥基磷灰石及其制備方法和應(yīng)用。公開號：C N1693410A”，或者將鋱、銪等“D o a t A.，F(xiàn) a n j u l M.，P e l l i e F.，Hollande E.，Lebugle A.，Biomaterials 2003，24，3365；Riwotzki K.，Meyssamy H.，S c h n a b l e g g e r H.A n g e w C h e m l n t E d.2001，40，573.”稀土離子摻雜到羥基磷灰石中，使其可發(fā)出熒光等，但這些材料的制備方法通常比較復(fù)雜，而且量子點和稀土元素的生物相容性還有待于考證。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服背景技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，所
得材料具有很好的生物相容性，穩(wěn)定的光學(xué)性質(zhì)，較窄的熒光激發(fā)波長范圍，適用于需要對羥基磷灰石進(jìn)行示蹤的環(huán)境中，尤其適用于羥基磷灰石和細(xì)胞間界面及作用機理的研究。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
配制重量百分比為1.5～3％的重碳酸鈉緩沖溶液，將異硫氰酸熒光素溶解在該緩沖溶液中，控制異硫氰酸熒光素在緩沖溶液中的濃度為0.02～0.1克每升；再將羥基磷灰石顆粒分散在上述溶液中，顆粒濃度為0.5～1.5克每升，攪拌0.5～2小時；利用羥基磷灰石的強吸附作用將異硫氰酸熒光素吸附到顆粒表面，再將該懸濁液避光環(huán)境保存在1～8℃下繼續(xù)作用10～20小時后，通過離心、透析和過濾作用除去顆粒表面未吸附的熒光素；將標(biāo)記好的羥基磷灰石顆粒在35～45℃避光環(huán)境中真空干燥，得到干燥的熒光標(biāo)記的羥基磷灰石顆粒。
所述熒光標(biāo)記的羥基磷灰石顆粒在溫度為110～125℃，壓力為104-108k P a，在15～20min下進(jìn)行滅菌。
所述熒光標(biāo)記的羥基磷灰石的最大吸收波長為490納米，最大發(fā)射波長為503納米。
本發(fā)明具有的有益效果是：
本發(fā)明采用的標(biāo)記物異硫氰酸熒光素是一種生物熒光素，具有較好的生物相容性；經(jīng)過長時間反應(yīng)和
充分洗滌之后，異硫氰酸熒光素已經(jīng)與羥基磷灰石
顆粒實現(xiàn)牢固結(jié)合，使用過程中不會從羥基磷灰石表面脫離下來對試驗結(jié)果造成負(fù)面影響；所得到的熒光物質(zhì)吸收峰范圍較窄，為480～510納米之間，適用于多種熒光同時存在的環(huán)境中。本發(fā)明可應(yīng)用于材料和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，尤其適用于羥基磷灰石顆粒與細(xì)胞相互作用時的界面、過程及機理研究。
附圖說明
圖1是經(jīng)過異硫氰酸熒光素標(biāo)記后的羥基磷灰石顆粒的熒光圖譜。
圖2是經(jīng)過異硫氰酸熒光素標(biāo)記后的羥基磷灰石顆粒的共聚焦顯微鏡圖片。 圖3是經(jīng)過異硫氰酸熒光素標(biāo)記后的羥基磷灰石顆粒在細(xì)胞中的共聚焦圖片。
具體實施方式
本發(fā)明中所用到的羥基磷灰石是一種弱堿性磷酸鈣鹽，包括人工合成的羥基磷灰石或動物體內(nèi)的羥基磷灰石，可通過固相反應(yīng)法、水熱法、水解法、共沉淀法、溶膠-凝膠法、微乳液法等或者通過煅燒動物骨的方法獲得，得到的顆粒是尺寸為10至10微米的羥基磷灰石顆粒，呈針狀、棒狀、球狀、多邊形狀
或不規(guī)則顆粒狀。
一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，以異硫氰酸熒光素為標(biāo)記物，使羥基磷灰石標(biāo)記過程在異硫氰酸熒光素水溶液中進(jìn)行，經(jīng)過反應(yīng)、低溫陳化、離心分離、洗滌、透析和密閉真空干燥工藝步驟在羥基磷灰石表面復(fù)合上異硫氰酸熒光素?zé)晒馕镔|(zhì)。
實施例1：
一種對羥基磷灰石進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法，選用直徑為40納米左右的球狀羥基磷灰石顆粒，其標(biāo)記過程依次為：
(1)將分析純的重碳酸鈉1.5克溶解于50毫升去離子水中，得到緩沖溶液，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解；
(2)取異硫氰酸熒光素粉末1毫克，溶解在上述第一步的重碳酸鈉溶液中，在黑暗環(huán)境下磁力攪拌30分鐘。
(3)取羥基磷灰石顆粒75毫克，放入上述第二步中配制好的異硫氰酸熒光素溶液中，黑暗環(huán)境下磁力攪拌0.5小時；
(4)將上述第(3)步懸濁液放置在4℃黑暗環(huán)境下低溫反應(yīng)10小時；
(5)對上述第(4)步所得懸液在8000g離心，分離出經(jīng)過標(biāo)記的羥基磷灰石顆粒，用去離子水離心清洗三次；
(6)分別將2.65克分析純碳酸鈉和18.9克分析純碳酸氫鈉溶解于500毫升去
