用GAP啟動子在畢赤酵母中組成型表達(dá)重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑

2023年12月4日發(fā)(作者：高中哲學(xué))

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第5卷 第3期

2014年3月

食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報

Vol. 5

No. 3

Journal of Food Safety and Quality Mar. , 2014

用GAP啟動子在畢赤酵母中組成型表達(dá)重組

獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑

曹東艷, 韓詩雯, 陳董鑫, 柳 倩, 賀曉云, 許文濤, 梅曉宏*

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院, 北京 100083)

摘 要: 目的 構(gòu)建組成型表達(dá)重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑(kiwi pectin methylestera inhibitor, kwPMEI)的畢赤酵母(P. pastoris)GS115工程菌株, 探索碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)對重組菌表達(dá)kwPMEI的影響, 純化kwPMEI并鑒定其對番茄果膠酶的抑制活性。方法 應(yīng)用PCR方法從P. pastoris GS115染色體中擴(kuò)增了三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(pGAP), 以其取代誘導(dǎo)型表達(dá)載體pPIC9K-kwPMEI上的醇氧化酶啟動子(pAOX1), 構(gòu)建了組成型表達(dá)載體pGAP9K-kwPMEI, 并轉(zhuǎn)化至GS115中。用Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析目的蛋白表達(dá)情況, 鎳柱親和層析純化目的蛋白, 并用凝膠擴(kuò)散方法鑒定其抑制活性。結(jié)果 重組畢赤酵母工程菌株成功組成型表達(dá)了kwPMEI, 48 h即達(dá)到最大表達(dá)水平, 表達(dá)量約為66 mg/L。并且以甘油為碳源時kwPMEI表達(dá)量最高。成功分離純化了kwPMEI, 并經(jīng)凝膠擴(kuò)散方法檢測表明其具有抑制活性。結(jié)論 成功構(gòu)建了組成型分泌表達(dá)kwPMEI的畢赤酵母菌株, 為kwPMEI在果蔬汁中的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞: 組成型表達(dá); 三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子; 獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑; 碳源; 畢赤酵母

Constitutive expression of kiwi pectin methylestera inhibitor in

Pichia pastoris using the GAP promoter

CAO Dong-Yan, HAN Shi-Wen, CHEN Dong-Xin, LIU Qian, HE Xiao-Yun,

XU Wen-Tao, MEI Xiao-Hong*

(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

ABSTRACT:

Objectives To construct P. pastoris strains GS115 which can constitutively express recombi-nant kiwi pectin methylestera inhibitor (kwPMEI) and to explore the effect of carbon source (gluco, glycerol

and methanol) on the expression of kwPMEI, purify kwPMEI, and identify its inhibitory capacity to the tomato

PME. Methods The GAP gene promoter was amplified from P. pastoris GS115 using PCR, and ud to replace

the AOX1 promoter (pAOX1) on pPIC9K-kwPMEI, resulting in plasmid pGAP9K-kwPMEI, which was sub-quently transformed into P. pastoris GS115. KwPMEI was identified by Tricine-SDS-PAGE and Western blot, and

purified by nickel affinity chromatography. The inhibitory capacity of kwPMEI was verified with a gel diffusion

assay. Results The combinant P. pastoris strain constitutively expresd kwPMEI successfully, and the peak

concentration of kwPMEI (66 mg/L) was obtained only after a 48-h fermentation. In addition, glycerol was the

best carbon source for producing kwPMEI. Finally, KwPMEI was successfully purified, and it showed an inhi-bitory capacity by gel diffusion assay. Conclusion The P. pastoris strains constitutively expressing kwPMEI were

*通訊作者: 梅曉宏, 副教授, 主要研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及轉(zhuǎn)基因食品的安全性研究。E-mail: xhmei0719@

*Corresponding author: MEI Xiao-Hong, Associate Professor, College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural Un-iversary, No.17, Qinghua East Road, Haidian District, Beijing 100083, China. E-mail:xhmei0719@ 第3期 曹東艷, 等: 用GAP啟動子在畢赤酵母中組成型表達(dá)重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑 965

constructed successfully, which built up the foundation for the further application of kwPMEI in juice industry.

KEY WORDS:

constitutive expression; GAP promoter; kiwi pectin methylestera inhibitor; carbon source;

P. pastoris

1 引 言

天然的新鮮果蔬汁一般會呈現(xiàn)出均一穩(wěn)定、分散良好的渾濁態(tài)。渾濁態(tài)在保持果蔬汁的顏色、風(fēng)味及質(zhì)地等感官品質(zhì)方面有著非常重要的作用, 但是, 隨著時間的延長, 果蔬汁往往會發(fā)生渾濁態(tài)消失的現(xiàn)象, 這主要是由于植物內(nèi)源性果膠甲酯酶(PME)對果膠的脫甲酯化作用而造成的[1]。而果膠甲酯酶抑制劑(PMEI)對PME有很強(qiáng)的抑制活性, 可有效解決渾濁態(tài)消失問題。但是直接從植物中提取PMEI產(chǎn)量很低,

而利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)就可大量生產(chǎn)重組PMEI,

以滿足果蔬汁加工業(yè)發(fā)展的需要。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn), 是目前應(yīng)用最為廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一[2]。截止到2005年, 已有500多個基因在畢赤酵母中成功表達(dá)[3]。pAOX1作為一種誘導(dǎo)型啟動子[4], 其構(gòu)成的畢赤酵母誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)只有以甲醇作為唯一碳源時, 才能表達(dá)和分泌外源蛋白。但是甲醇是一種有毒的物質(zhì),

并且在大規(guī)模生產(chǎn)過程中易燃、易爆, 很不安全。除此之外, 在高密度發(fā)酵過程中, 把碳源從甘油更換到甲醇也很不方便。最近十幾年來, 科學(xué)家們一直致力于尋找新的組成型啟動子來替代pAOX1。1997年,

Waterham等[5]首次發(fā)現(xiàn)并分離了pGAP。自此以后,

揭開了用pGAP構(gòu)成的組成型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的新篇章。該組成型表達(dá)系統(tǒng)不需要把碳源從甘油更換到甲醇, 因此避免了儲藏和運(yùn)輸甲醇的花費(fèi)和危害, 更適合大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白。除此之外, 該表達(dá)系統(tǒng)相對于誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)大大縮短了發(fā)酵周期,

提高了生產(chǎn)率。

梅曉宏等[6]利用畢赤酵母pAOX1系統(tǒng)首次誘導(dǎo)表達(dá)了獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑(kwPMEI), 但是應(yīng)用畢赤酵母組成型分泌表達(dá)kwPMEI的研究, 國內(nèi)外尚未見報道。本文首次構(gòu)建了組成型分泌表達(dá)kwPMEI的畢赤酵母表達(dá)菌株, 在pGAP調(diào)控下, 成功組成型分泌表達(dá)了kwPMEI, 促進(jìn)了其在果蔬汁加工業(yè)中的應(yīng)用。

2 材料與方法

2.1 材 料

2.1.1 菌株與載體

畢赤酵母GS115及表達(dá)載體pPIC9K-kwPMEI由作者實(shí)驗(yàn)室保存; DH5α及克隆載體pGEM-Teasy購自天根公司。

2.1.2 酶與試劑

高保真的PfuDNA聚合酶、Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購于大連寶生物公司; T4連接酶購于Promega公司; DNA膠回收試劑盒購于康為試劑公司; 抗His6-Tag-AP單克隆抗體、山羊抗小鼠單克隆抗體購于碧云天公司; 其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)之分析純。

2.1.3 儀 器

PCR儀(美國Bio-Rad公司); 高速冷凍離心機(jī)和電轉(zhuǎn)儀(德國Eppendorf公司); 鎳柱(美國GE公司);

電泳儀(北京六一儀器廠); 凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司); 酶標(biāo)儀(美國Thermo公司); 紫外可見分光光度計(上海尤尼柯有限公司)。

2.1.4 培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基: 1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%的葡萄糖; LB培養(yǎng)基: 1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化鈉; MD培養(yǎng)基: 1.34%YNB、2%葡萄糖、4×10-5%生物素。固體培養(yǎng)基再加2%的瓊脂粉。

2.2 方 法

2.2.1 重組質(zhì)粒pGAP9K-kwPMEI的構(gòu)建

根據(jù)發(fā)布的pGAP序列[5], 設(shè)計上游引物(5′-GCGAGCTCCCTTTTTTGTAGAAATGTC-3′; 劃線的為Sac I酶切位點(diǎn))和下游引物(5′-CGGGATCCTGTGTTTTGATAGTTGTTC-3′; 劃線的為BamH I酶切位點(diǎn)), 由上海生工公司合成, 以P．pastoris GS115基因組為模板, 用PCR擴(kuò)增pGAP片段, 并將其克隆到載體pGEM-Teasy上, 構(gòu)建了載體pGEM-Teasy-pGAP。用Sac I和BamH I同時雙酶切載體pGEM-Teasy-pGAP和pPIC9K-kwPMEI, 膠回收目的片段后, 通過T4連接酶連接, 構(gòu)建了載體966 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報 第5卷

pGAP9K-kwPMEI。

2.2.2 畢赤酵母宿主菌轉(zhuǎn)化及陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

用Sal I單酶切質(zhì)粒pGAP9K-kwPMEI, 經(jīng)膠回收后, 通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到is GS115基因組中。用含1.0、2.0、3.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。畢赤酵母基因組中目的基因kwPMEI的拷貝數(shù)越多, 對抗生素G418的抗性就會越強(qiáng), 表達(dá)目的蛋白kwPMEI的量也就會越高。因此,

從G418濃度最高的平板上挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行組成型表達(dá)kwPMEI。

2.2.3 組成型表達(dá)kwPMEI

將用4.0 mg/mL G418篩選的高拷貝重組畢赤酵母菌株在新鮮YPD平板上劃線, 于30 ℃, 倒置培養(yǎng)2天。挑取單菌落接種于5 mL YPD培養(yǎng)基中, 過夜培養(yǎng), 按1%接種量取2 mL菌液接種于20 mL YPD培養(yǎng)基中, 用250 mL三角瓶進(jìn)行培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為:

28 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。每隔24 h補(bǔ)加甘油至終濃度1%, 培養(yǎng)72 h。每隔12 h取樣, 用于測定菌體密度OD600, 蛋白濃度和進(jìn)行Western blot分析。蛋白總濃度用Bradford法[7]測定, 而kwPMEI的濃度用BandScan軟件結(jié)合蛋白總濃度進(jìn)行計算。

2.2.4 補(bǔ)加碳源的優(yōu)化

按1%接種量將菌液接種于20 mL YPD培養(yǎng)基后,

每隔24 h分別補(bǔ)加不同的碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)至其終濃度為1%, 在最佳發(fā)酵時間收集發(fā)酵上清液,

并測定kwPMEI的濃度。

2.2.5 kwPMEI的純化及抑制活性鑒定

發(fā)酵上清液經(jīng)離心后, 用5 mL鎳柱進(jìn)行親和層析純化。結(jié)合液為: 50 mmol/L NaH2PO4, 300 mmol/L

NaCl, 10 mmol/L咪唑, pH 8.0; 洗脫液為: 50 mmol/L

NaH2PO4, 300 mmol/L NaCl, 250 mmol/L咪唑, pH

8.0。純化的kwPMEI用Tricine-SDS-PAGE進(jìn)行分析。kwPMEI對于番茄果膠甲酯酶的抑制活性用凝膠擴(kuò)散方法[8]進(jìn)行檢測, 其中用硫酸銨沉淀法[9]提取番茄果膠甲酯酶。

3 結(jié)果與分析

3.1 重組質(zhì)粒pGAP9K-kwPMEI的構(gòu)建

根據(jù)發(fā)布的pGAP序列設(shè)計引物, 以P．pastoris

GS115基因組為模板, 用PCR方法擴(kuò)增出了約500

bp左右的pGAP片段(圖1A), 與預(yù)期結(jié)果一致。測序結(jié)果證實(shí), 克隆到載體pGEM-Teasy-pGAP上的pGAP片段正確。通過酶切連接的方法構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGAP9K-kwPMEI, 其具體構(gòu)建過程如圖1B所示。重組質(zhì)粒pGAP9K-kwPMEI經(jīng)Sac I和BamH I雙酶切鑒定, 可見兩條電泳條帶9000 bp和500 bp(圖1C),

其大小正確。測序證實(shí)pGAP9K-kwPMEI構(gòu)建成功。

3.2 組成型表達(dá)kwPMEI

不同時間kwPMEI的表達(dá)水平及重組菌的生長狀況分析結(jié)果(圖2)表明: 在pGAP的調(diào)控下,

kwPMEI很快就開始表達(dá), 并且隨著時間的延長kwPMEI表達(dá)量逐漸增加, 在48 h時產(chǎn)量達(dá)到最高值,

之后隨著時間的延長kwPMEI的表達(dá)量下降, 這可能是因?yàn)榈鞍酌傅慕到鈁10]。由此, 確定了最佳發(fā)酵時間為48 h。kwPMEI的C段融合了His6標(biāo)簽, 能與抗His6-Tag-AP單克隆抗體結(jié)合, 如圖2B所示, Western

blot分析顯示在20 kDa左右處有一蛋白條帶, 其大小稍大于其原本大小(17 kDa)[11], 可能是由于畢赤酵母中翻譯后的糖基化修飾。

3.3 碳源對組成型表達(dá)kwPMEI的影響

發(fā)酵48 h后離心收集上清液, 并測定蛋白濃度。如圖3所示, 當(dāng)補(bǔ)加甘油時, kwPMEI的表達(dá)量最高。而補(bǔ)加甲醇時kwPMEI的表達(dá)量最低。研究表明, 有的蛋白在補(bǔ)加甘油時表達(dá)量高于葡萄糖[12], 而有的蛋白在補(bǔ)加甘油時表達(dá)量卻低于葡萄糖[5], 這主要由表達(dá)的蛋白種類而定。

3.4 kwPMEI的純化及抑制活性檢測

蛋白電泳Tricine-SDS-PAGE分析結(jié)果顯示(圖4A), 通過鎳柱親和層析后, 能夠得到單一的kwPMEI條帶, 表明該方法能夠成功分離純化kwPMEI。經(jīng)過凝膠擴(kuò)散分析(圖4B), 組成型表達(dá)的kwPMEI能夠有效抑制番茄PME的活性, 表明純化后的kwPMEI仍然具有活性, 同時也說明鎳柱親和層析能夠有效地保持蛋白的活力, 不會使蛋白失活。

4 討 論

雖然is的pAOXl系統(tǒng)廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)重組蛋白[13-15], 但由于該系統(tǒng)需用危險性高的甲醇作為碳源, 發(fā)酵時間長, 并且生產(chǎn)過程中需要進(jìn)行碳源轉(zhuǎn)換等缺點(diǎn), 制約了其在外源蛋白大規(guī)模生產(chǎn)中的應(yīng)用。自從Waterham等[5]首次發(fā)現(xiàn)并分離pGAP以后, 陸續(xù)有報道稱用pGAP構(gòu)成的組成型表達(dá)系統(tǒng) 第3期 曹東艷, 等: 用GAP啟動子在畢赤酵母中組成型表達(dá)重組獼猴桃果膠甲酯酶抑制劑 967

圖1 重組質(zhì)粒pGAP9K-kwPMEI的構(gòu)建

Fig. 1 Construction of recombinant vector pGAP9K-kwPMEI

注: A: 以酵母基因組為模板擴(kuò)增pGAP, 1: 陰性對照, 2: 擴(kuò)增的pGAP; B: pGAP9K-kwPMEI的具體構(gòu)建過程;

C: Sac I和BamHI雙酶切鑒定pGAP9K-kwPMEI, 1: 雙酶切結(jié)果, 2: 質(zhì)粒pGAP9K-kwPMEI。

成功表達(dá)了外源蛋白[16-19]。另外, GAP啟動子衍生的巴斯德畢赤酵母組成型表達(dá)系統(tǒng)可以采用連續(xù)發(fā)酵的模式, 避免了pAOX1誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)分批發(fā)酵的不便。Goodrick等[20]利用高密度發(fā)酵組成型表達(dá)了人幾丁質(zhì)酶, 發(fā)現(xiàn)采用分批發(fā)酵策略表達(dá)人幾丁質(zhì)酶時容易降解, 而用連續(xù)發(fā)酵策略表達(dá)時沒有觀察到酶的降解, 表明pGAP表達(dá)系統(tǒng)更適合大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的大部分啟動子在表達(dá)外源蛋白時都受到碳源的控制, 優(yōu)化碳源是提高畢赤酵母組成型表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量的重要策略之一[21]。Dring等[22]利用pGAP系統(tǒng)表達(dá)兔腎肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白時,

發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源時其表達(dá)量是甘油的2倍。而Menendez等[23]的研究結(jié)果及本文結(jié)果表明以甘油為碳源能獲得更多的產(chǎn)物。不同碳源對不同蛋白表達(dá)的影響各不相同, 只能通過具體的實(shí)驗(yàn)來確定最佳碳源。

畢赤酵母表達(dá)中常遇到的另一個問題是由于宿主蛋白的存在, 經(jīng)常使產(chǎn)物不穩(wěn)定, 影響表達(dá)量。為避免表達(dá)產(chǎn)物被蛋白酶降解, 所以要優(yōu)化表達(dá)時間或加入蛋白酶抑制劑, 或選擇蛋白水解酶缺陷型菌株。此外, 源于pGAP的畢赤酵母組成型表達(dá)系統(tǒng)對 968 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報 第5卷

圖2 不同時間kwPMEI的表達(dá)水平及重組菌的生長狀況分析

Fig. 2 Analysis of the expression level of kwPMEI and the

cell growth status

注: A圖中n=3, B為Western blot分析

圖3 碳源對表達(dá)kwPMEI的影響(n=3)

Fig. 3 Effect of carbon source on kwPMEI expression

于某些蛋白的分泌并不能達(dá)到理想的效果, 而且只能表達(dá)對細(xì)胞沒有毒害的外源蛋白, 這都在一定程度上限制了畢赤酵母組成型表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。但是,

隨著發(fā)酵工藝的不斷完善和對畢赤酵母組成型表達(dá)

圖4 kwPMEI的純化及抑制活性檢測

Fig. 4 PurificationkwPMEI and detection its inhibitory

activity

注: A: Tricine-SDS-PAGE分析, 1: 表達(dá)上清, 2: 鎳柱純化kwPMEI結(jié)果; B: 1: 番茄PME, 2: 番茄PME+純化的kwPMEI; 其中凝膠中含有0.1%的果膠。

系統(tǒng)的深入研究, 此組成型表達(dá)系統(tǒng)將會擁有更美好的未來。

本研究用pGAP表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)并分離純化了有活性的kwPMEI, 為kwPMEI的進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)和發(fā)酵罐發(fā)酵奠定了基礎(chǔ); 構(gòu)建的適合工業(yè)化生產(chǎn)kwPMEI的酵母工程菌株具有良好的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景, 為kwPMEI在果蔬汁中的進(jìn)一步應(yīng)用打下了鋪墊。

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(責(zé)任編輯: 張宏梁)

作者簡介

曹東艷, 碩士研究生, 主要研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

E-mail: caody2012@

梅曉宏, 副教授, 主要研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)及轉(zhuǎn)基因食品的安全性研究。

E-mail: xhmei0719@

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