細胞色素C的制備及測定

2023年12月8日發(作者：一暴十寒的意思)

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實驗三 吸附法制備細胞色素 C 粗品

一、實驗目的

1．學習細胞色素 C 的理化性質及其生物學功能。

2．掌握制備細胞色素 C 的原理。

3．掌握制備細胞色素 C 的操作技術。

二、實驗原理

細胞色素 C（cytochrome,Cyt）是呼吸鏈的一個重要組成成份。是一種含鐵卟啉基團的

蛋白質，在線粒體呼吸鏈上位于細胞色素 b 和細胞色素 aa3

之間，細胞色素 C 的作用是在生

物氧化過程中傳遞電子。

細胞色素 C 分子中含賴氨酸較高，所以等電點偏堿，為 pH 10.8，分子量為 12000～13000

道爾頓。它易溶于水及酸性溶液，且較穩定，不易變性，組織破碎后，用酸性水溶液即能從

細胞中浸提出來。細胞色素 C 分為氧化型和還原型兩種，因為還原型較穩定并易于保存，

一般都將細胞色素 C 制成還原型的，氧化型細胞色素 C 在 408nm、530nm 有最大吸收峰，

還原型細胞色素 C 的最大吸收峰為 415nm、520nm 和 550nm，這一特性可用于細胞色素 C

的含量測定。

由于細胞色素 C 在心肌組織和酵母中含量豐富，常以此為材料進行分離制備。本實驗

以豬心為材料，經過酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸銨溶液洗脫，三氯醋酸沉淀等步驟制

備細胞色素 C，并測定其含量。

三、實驗材料

1. 實驗器材

絞肉機；電磁攪拌器；電動攪拌器；離心機；72l 型分光光度計； 燒杯(2000、1000、

500m1)；量筒；移液管；玻璃漏斗和紗布；玻璃棒；透析袋

2. 實驗試劑

⑴ 1M H2S04

溶液；1M NH40H 溶液；固體硫酸銨

⑵ 25％硫酸銨溶液: 100m1 蒸餾水中含 25 克硫酸銨，約相當于 25℃時 40％的飽和度

⑶ 0.2％氯化鈉溶液：稱 0.2 克氯化鈉，用蒸餾水溶解并定容至 100ml.

⑷ 10%乙酸鋇試劑： 稱 10 克乙酸鋇 , 溶于 100ml 蒸餾水中。

⑸ 20％三氯醋酸溶液

(6) 人造沸石(60～80 目)

1 ⑺ 聯二亞硫酸鈉(Na2S2O4·2H2O)

3. 實驗操作

（1）細胞色素 C 的制備

① 材料處理: 取新鮮或冰凍豬心，除去脂肪和韌帶，用水洗去積血，將豬心切成小塊，放入絞肉機絞碎。

②提取:

稱取絞碎豬心肌肉 500 克，放人 2000m1 燒杯中，加蒸餾水 1000ml，在電動攪拌器攪拌

下以 1M H2S04

調 pH 至 4.0(此時溶液呈暗紫色)，在室溫下攪拌提取 2 小時，在提取過程，

使抽提液的 pH 值保持在 4.0 左右。在即將提取完畢，停止攪拌之前，以 1M NH4OH 調 pH

至 6.0，停止攪拌。用八層普通紗布壓擠過濾，收集濾液。濾渣加入 750m1 蒸餾水，再按上

述條件提取 1 小時，兩次提取液合并。

③ 中和:

用 1M NH4OH 調上述提取液至 pH 7.2(此時，等電點接近 7.2 的一些雜蛋白溶解度小，從

溶液中沉淀下來)，靜置 30～40 分鐘中后過濾，所得濾液準備通過人造沸石進行吸附。

④ 吸附與洗脫:

每組取大約 60ml 過濾液，用于人造沸石容易吸附細胞色素 C，吸附后能被 25％的硫酸

銨洗脫下來，利用此特性將細胞色素 C 與其它雜蛋白分開。具體操作如下：

Ⅰ.人造沸石的預處理：稱取人造沸石 5g，放入 500m1 燒杯中，加水攪拌，用傾瀉法除

去 12 秒鐘內不下沉的過細顆粒。

Ⅱ 吸附：將樣品加入至盛人造沸石有小燒杯中，人造沸石吸附物質后逐漸由白色變為

紅色，吸附后的溶液呈黃色或微紅色；

Ⅲ 洗滌：吸附完畢，倒去溶液，將紅色人造沸石取出，放入 500m1 燒杯中，先用自來

水，后用蒸餾水輕輕攪拌洗滌至水清，再用 50m1 0.2％NaCl 溶液分三次洗滌沸石，再用蒸

餾水洗至水清；

Ⅳ 洗脫：用 25％硫酸銨溶液洗脫，輕輕攪拌，收集含有細胞色素 C 的紅色洗脫液，經

過幾次洗脫后（每次洗脫以蓋過沸石），洗脫液紅色開始消失時，即洗脫完畢。人造沸石可

再生使用。

⑤鹽析：

為了進一步提純細胞色素 C，在上面收集的洗脫液中，加入固體硫酸銨(按每 l00m1 洗

脫液加入 20 克固體硫酸銨的比例，使溶液硫酸銨的飽和度為 45％),邊加邊攪拌，放置 30 分

2 鐘后，雜蛋白便從溶液中沉淀析出，而細胞色素 C 仍留在溶液中，用濾紙(或離心)除去雜蛋

白，即得紅色透亮細胞色素 C 溶液。

⑥ 三氯醋酸沉淀：

向所得透亮溶液加入 20％三氯醋酸(2.5m1 三氯醋酸／100m1 細胞色素 C 溶液)，攪拌，

細胞色素 C 立即沉淀出來（沉淀出來的細胞色素 C 屬可逆變性)，立即于 3000 轉／分鐘離

心 15 分鐘(或 8000rpm,5min)，收集沉淀。加入少許蒸餾水，用玻棒攪拌，使沉淀溶解。

⑦ 透析：

將沉淀的細胞色素 C 溶解于少量的蒸餾水后，裝入透析袋，在 500m1 燒杯中對蒸餾水

進行透析除鹽(電磁攪拌器攪拌)，15 分鐘換水—次，換水 3 至 4 次后；檢查透析外液 SO4

是否已被除凈。檢查方法是：取 2m1 乙酸鋇溶液于試管中，滴加 2 至 3 滴透析外液至試管

中，若出現白色沉淀，表示 S04

未除凈，反之，說明透析完全，將透析液過濾，即得細胞色

素 C 制品。

⑵ 含量測定

所得制品是還原型細胞色素 C 水溶液，在波長 520nm 處有最大吸收值，根據這一特性，

用 721 型分光光度計，先作出一條標準細胞色素 C 濃度和對應的光密度值的標準曲線(圖 1)，

然后根據測得的待測樣品溶液的光密度值就可以由標準曲線的斜率求出待測樣品的含量。具

體操作如下：

① 標準曲線的繪制：

取 1 毫升標準品(81mg/ml)，稀釋至 25ml，從中分別取 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml，分

別置于五支試管中，每管補加蒸餾水至 4m1，并加少許聯二亞硫酸鈉作還原劑，然后在 520nm

處測得各管的光密度，以濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，作出標準曲線圖。

② 樣品測定

取 1ml 樣品，稀釋適當倍數，再加少許聯二亞硫酸鈉(約 3－5mg, 檢測前加入)，在波長

520nm 處測定光密度。最后根據標準曲線的斜率計算其細胞色素 C 的含量。

注意事項

1．盡可能除掉豬心中的韌帶、脂肪和積血。

2．使用離心機之前，一定要配平。

3．透析之前要檢查透析袋。

4．在520nm處測得各管的光密度時，要加少許聯二亞硫酸鈉作還原劑。

3 4. 實驗結果

① 請按下列結果用電腦繪制標準曲線，得出方程和斜率

② 測量結果

標準品

體積

濃度

OD

5. 思考題

樣品

0.8 1.0

0.2

0.4

0.6

0.175 0.333 0.508 0.673 0.848

1．本實驗采用的酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸銨溶液洗脫，三氯醋酸沉淀等步驟

制備細胞色素及含量測定，各是根據什么原理?

2.影響細胞色素c得率的因素有哪些？

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