叢枝菌根實驗方案

2023年12月21日發(作者：給年輕人的忠告)

叢枝菌根實驗方案

1. 李曉林(1990)采用三室的試驗裝置，利用30μm的尼龍網將根與菌絲分開，建立了菌絲際。該方法為研究菌絲及其菌絲際的生理生化變化提供了一條有用的途徑。但是它仍然不能排除外界微生物及灌溉施肥等措施造成的影響，為了進一步研究菌絲的生理生化變化，必須建立一種無雜菌的菌絲際環境，將離體雙重培養條件下形成共生體中的根與菌絲分離開來，使菌絲進入菌絲室，而將根阻止在菌根室中，不讓二者混在一起，為深入研究菌根菌絲的生理生化特性提供新的技術和方法。

2. Glomus intraradices孢子較小，其直徑為44μm一117μm，平均77μm，呈橢球形或球形，顏色為淡黃色，其孢子的萌發是從聯孢菌絲的斷口處重新伸出菌絲(圖4—1圖版I一6)，而后再伸長、分枝，形成一個密集分枝的菌絲體。它的萌發不同于G．margarita孢子和S．sinuosa孢子果的萌發。雖然較前兩種孢子和孢子果的芽管數略少，但它仍具有很強的侵染潛力，可能同其具有很強的分枝能力有關。一旦萌發，菌絲的分枝速度很快。G．intraradices菌絲的分枝呈垂直方向。新生成的菌絲較聯孢菌絲直徑更細，對根段進行侵染會更容易。

3. 菌根室中共生聯合體的建立：將有機玻璃條用玻璃膠黏貼在直徑為9cm的培養皿底部，將培養皿分為兩室，防止兩室的培養基質進行營養交換。將30μm的尼龍網黏貼在有機玻璃條及培養皿壁，直至培養皿上蓋，阻止根的進入(圖4—2)。將轉移RiT—DNA胡蘿卜根與萌發的G．intraradicesSchenck&Smith叢枝菌根真菌孢子，共同培養的室稱為菌根室(MC)，而將菌絲穿過尼龍網進入的室稱為菌絲室(HC)。圖4—2培養皿中的兩室試驗裝置將M培養基10mL倒入菌根室中，用于離體雙重培養叢枝菌根真菌與轉移RiT—DNA胡蘿I-根。在菌絲室中：①倒入10mL的瓊脂培養基質，其中含有NO3-N或NH4-N(N的含量與M培養基中相同)，其pH分別為6．0或6．5，基質中含有0．6％溴甲酚紫作為指示劑；②倒入10mL不含蔗糖的M培養基，pH為5．5。在相應的菌根室中接種G．intraradices孢子。截取在M培養基上生長的轉移RiT—DNA胡蘿i-根的根尖5cm-7cm置于菌根室中，將萌發的孢子移入根旁空處，由于G．intraradices孢子直徑小，每個培養皿移進30個孢子。將培養皿在27℃±1℃的恒溫培養箱中黑暗培養。

4. 菌根室中共生聯合體生長狀況：G．intraradices菌根真菌相似于G．margarita菌根真菌，其生成的菌絲在與根相遇時入侵根段，在根細胞內形成叢枝。培養近一個月后，在培養基質中形成了大量的營養孢子及成熟的孢子(圖4—3)。營養孢子的大小為4lμm-62μm，平均為49μm，而成熟孢子的大小范圍是67μm一93μm，平均大小為78μm。

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成熟的孢子顏色較暗，孢子壁較厚。營養孢子中充滿油滴，可以為菌絲的生長提供能源物質。

5. 在觀察菌絲生長的過程中，菌根真菌的菌絲中能觀察到原生質的雙向流動。菌絲內原生質的雙向流動有助于進一步探索菌絲對物質運輸的作用。菌絲內原生質的雙向流動是菌根真菌的一種普遍現象，菌根真菌與宿主共生聯合關系的建立也依賴于這種雙向流動的驅動力(Smith，1997)。孢子不僅是作為叢枝菌根真菌養分儲存的器官，更是一種穩定的繁殖體，它的形態特征目前仍是叢枝菌根真菌分類學的重要依據。目前孢子收集的方法主要有濕篩傾析法、柱析法、漂浮法和離心法，但是常用的方法仍是濕篩傾析法和離心法(李曉林、馮固，2001)。這些方法的共同點都是能夠將菌根孢子從生長基質中富積起來，但是孢子與基質的小顆粒特別是沙粒顏色相近，不易于辨別。

6. 測定叢枝菌根孢子密度方法一：常規的濕篩傾析法(Gerdemann和Nieolson，1963)：(1)稱取一定重量的土壤樣品，放在容器內用水浸泡20min-30min，盡量使土壤松散。如果土壤黏性很大，也可加入各種土壤分散劑。(2)選用一套潔凈的、孔徑為0．5μm一0．034μm的土壤篩，按孔徑由大至小的順序從上到下依次疊放，最底層用一固體物墊著，使篩面稍微傾斜。(3)用玻璃棒攪動浸泡土壤的水溶液，停置幾秒鐘后，使大的石礫和雜物沉淀下去，然后將懸浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一層的土壤篩上，傾倒時，集中倒在篩面的一個點上，避免整個篩面都沾有土壤溶液。(4)用清水依次輕輕沖洗停留在篩面上的篩出物，以免在上層粗篩面的剩留物中殘留有叢枝菌根真菌孢子，用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個清潔的培養皿里面。(5)將濾液通過細篩并用水沖洗。在細篩面上沖洗下來的篩出物中，除了有許多細的沙礫和雜質外，就含有叢枝菌根真菌的不同直徑的孢子。(6)將含有篩出物的培養皿放在雙目實體解剖顯微鏡下觀察并計數。

7. 測定叢枝菌根孢子密度方法二：濕篩傾析染色法(簡稱染色法)改進的濕篩傾析法，前4步驟同方法一。(5)用洗瓶將停留在篩面上的篩出物輕輕沖洗到一個清潔的試管內，滴加曲利苯藍染色劑，放在90。C水浴鍋或烘箱中加熱半小時，進行染色。(6)將染色后的濾液通過細篩，并沖洗篩上的濾物，可洗去染色劑，將篩出物放在清潔的培養皿里。在沖洗下來的篩出物中，除了有許多細的沙礫和雜質外，就含有叢枝菌根真菌的不同直徑的孢子。(7)將含有篩出物的培養皿放在雙目實體解剖顯微鏡下觀察并計數，可觀測到紫色孢子。

8. 兩種方法對菌根孢子的形態特性以及測定精度比較：由于孢子是菌根生態分類的主要依據。孢子在土壤中主要呈無色透明、白色、淡黃、黃棕、棕色、金黃、紅棕和黑色等顏

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色(李曉林、馮固，2001)，許多孢子的顏色與基質沙土的顏色相近，在計數時不易被分辨出來而造成計數誤差。利用兩種不同的方法來觀測菌根孢子的形態特性，發現有明顯的區別。常規的濕篩傾析法，在雙目實體解剖顯微鏡下觀測到孢子呈棕黃色(圖5—1圖版11—1)，且孢子顏色與沙粒接近。而利用染色法觀測到孢子呈紫色(圖5～2圖版Ⅱ一2)，通過濕篩傾析法篩選出的菌根孢子或多或少帶有菌絲，菌絲同時也被染色，與周圍沙粒顏色反差較大，觀測孢子形態特性比較明顯，孢子的圖5—1濕篩傾析法觀測到孢子形態(棕黃色)圖5—2染色法觀測到的孢子形態(紫色)識別更是一目了然。因此菌根孢子很容易在染色劑作用下著色，呈紫色。在顯微鏡下觀測孢子的數量，效果明顯，易于識別，同時降低了孢子密度測定過程中的人為誤差，提高了孢子密度測定的精度，染色后的孢子(紫色)比沒染色的孢子(棕黃色)易于觀測，可以明顯地提高計數工作效率。以寧夏大武口煤矸石山接種菌根處理的沙土樣品為例，本試驗條件下以傳統的濕篩傾析法來統計孢子密度，10g沙土樣品孢子數平均為350個。而利用染色法來測定相同樣品的孢子數平均為380個。每個土壤樣品精度上平均提高了8％，染色法較常規的濕篩傾析法更易于識別和辨認，提高了孢子密度測定的精度。叢枝菌根培養新技術及其對土地復墾生態效應識別更是一目了然。因此菌根孢子很容易在染色劑作用下著色，呈紫色。在顯微鏡下觀測孢子的數量，效果明顯，易于識別，同時降低了孢子密度測定過程中的人為誤差，提高了孢子密度測定的精度，染色后的孢子(紫色)比沒染色的孢子(棕黃色)易于觀測，可以明顯地提高計數工作效率。以寧夏大武口煤矸石山接種菌根處理的沙土樣品為例，本試驗條件下以傳統的濕篩傾析法來統計孢子密度，10g沙土樣品孢子數平均為350個。而利用染色法來測定相同樣品的孢子數平均為380個。每個土壤樣品精度上平均提高了8％，染色法較常規的濕篩傾析法更易于識別和辨認，提高了孢子密度測定的精度。

9. 兩種方法對孢子密度測定速度的比較：常規的濕篩傾析法測定孢子密度，本研究條件下需要45min-50min時間來計數完成一個樣品(350個孢子／10g)。而利用染色法則需要花費25min～30min時間來計數完成1個樣品(380個孢子／10g)，測定速度上1個樣品縮短了一半時問(25 min-30min)，本試驗40個土樣，在測定速度上節約1000min一1200min，即20h。40個樣品在染色過程中可以一次在水浴鍋或烘箱中進行染色30min，操作簡單可行且染色時多個樣品可以一次完成，耗時少，染色法與常規的濕篩傾析法相比，僅多了染色一個環節，因此利用該染色法能夠極大地提高孢子密度測定的速度，為大規模樣品的孢子密度監測提供了一種快速的方法，尤其對于初學菌根技術的人更是一

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種可行的快速測定方法。該方法與常規的濕篩傾析法相比，也存在不足，經過在90℃水浴鍋或烘箱里加熱30min染色后的孢子失去了活力變成了死孢子，孢子不能再發芽被利用，因此該方法用于大規模測定孢子密度總量是快速可行的，但是不能區分樣品中叢枝菌根的種類和活性，因而不適合用于收集活孢子。5．5小結(1)染色法對于陜速測定叢枝菌根孢子密度總量是可行的，精度較高，對于大批量樣品孢子密度的測定可行。(2)染色法不足之處是孢子經高溫加熱和染色，不同種或屬孢子不易于識別，活孢子數量不能夠統計準確。因此本方法不適合測定活性孢子密度統計。

10. 接種劑孢子含量的測定：通常采用濕篩—傾注，蔗糖離心法。具體方法是，稱取一定重量或體積的待測菌劑10-100g或10-100m1，放人大燒杯中加500-1000ml水，攪拌，靜置10s后過雙層分樣篩(上篩20目，下篩400目)。反復沖洗待測樣品并過篩3-4次，收集400目篩子上的殘留物于大離心管中，3000r／min離心3min后去掉上清液，加人45％一50％的蔗糖，攪勻后迅速放人離心機，1500r／min離心1．5min馬上過400目篩，并用水輕輕沖洗篩子上面的殘留物，用生理鹽水收集于培養皿中備用。活體染色后在解剖鏡下即可計數。有時也可將蔗糖液直接用濾紙過濾，置該濾紙于解剖鏡下計數新鮮有活力的孢子，就可測定出單位重量或體積接種劑所含有的孢子數量。回收蔗糖液可重復再用。

11. 菌根侵染狀況觀察與侵染率測定：(1)活體鏡檢法：將要檢查的植物從容器或田間輕輕挖出，不要傷根，用水緩慢洗凈根表土壤及其他雜物。然后，即可放入培養皿或濾紙上，在配有冷光源的雙目實體鏡下，用冷落射光觀察。如有菌根侵染，可以看到根上有無隔菌絲、根外孢子，接至可以看到根內孢子或泡囊等。觀察完畢后隨即將苗子重新栽植到原來的位置，令其繼續生長。此法的優點是可連續活體觀察多次，能及時大體了解菌根發育情況，并可節省植株。缺點是并不十分準確。(2)染色鏡檢法：為了精確檢查菌根發育狀況、測定侵染率，則需采用染色法。一般要經過根系透明—染色—分色過程。具體作法是將根段或經過FAA固定的根系剪成長0.5-1.0cm小段放人試管或其他染色容器，加入5％-10％KOH溶液，放在90℃水浴鍋內20-60min，通常草本植物的幼嫩根系透明時間較短，而木本植物的根系則較長。去掉堿液然后用自來水輕輕沖洗根系3次，再加入2％的HCl溶液浸泡酸化5min。去掉酸液后加入酸性品紅(0．01％)乳酸甘油染色液(乳酸875ml，甘油63ml，蒸餾水63ml，酸性品紅0．1g)，再放回90℃水浴鍋內20-60min，或室溫下過夜。回收染色液可重復再用。加入乳酸分色后即可鏡檢、如用乳酸酚翠盤藍(0．05％)染色液(石炭酸300g，乳酸250ml，甘油250ml，蒸餾水300ml；

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翠盤藍(Trypan blue 0．5g)則不必加入HCl酸化，可以直接染色，并可用水分色。植物細胞不著色(有時中柱著色)，真菌組織染成紅色(酸性品紅染色)或藍色(翠盤藍染色)。在解剖鏡或顯微鏡下可以清晰地看到菌根的組織結構，并可采用多種方法測定侵染率，常用的有方格交叉法和根段頻率標準法(Biermann＆Lindermanl981)。這里只介紹比較簡便而精確的根段頻率標準法。該方法測定的結果在一定程度上能反映出菌根侵染的程度。將經過上述染色處理的根樣，用鑷子和挑針挑選25條粗細一致的根段整齊地排列在干凈載玻片上，加蓋潔凈的蓋玻片后即可觀察測定。每個處理需要測定200條根段。在顯微鏡下檢查每條根段的侵染情況，根據每段根系菌根結構的多少按0，10，20，30，…100％的侵染數量給出每條根段的侵染率。例如，沒有菌根結構的根段其侵染率為0，如果該條根段全部被侵染則為100％，只有一半長度的根段被侵染形成菌根的則該根段的侵染率為50％，依此類推，并記錄各侵染率下根段的條數。依下列公式即可計算該樣品菌根的侵染率。另外，可利用目鏡測微尺測定單位根系長度泡囊、侵入點的數量。對于根內泡囊、叢枝、菌絲、根外孢子、根上菌絲、侵入點等結構可根據需要拍攝顯微照片。觀察所用的玻片放人培養皿內可短期保存。經過上述方法處理的根段，制片并用光學樹脂膠、五色指甲油等封固后可長期保存。

12. 叢枝菌根真菌的接種方法叢枝菌根真菌有多種接種方法，可根據不同目的和需要選擇適當的接種方法。然而不管采用何種方法，操作人員和有關器具必須在接種前進行消毒處理，以盡量減少污染的機會。對需要接種處理的植物種子、根系、培養植物用的各種容器和培養基質、苗床和苗圃土壤等都要消毒甚至滅菌；對于大田土壤有條件的最好也進行消毒處理。另外，必須注意，接種劑類型、接種物形式、劑量和接種方法的不同會直接影響(施亞琴等1993，Yineta1．1997)叢枝菌根真菌的接種效果。一、按接種物形式區分的接種方法：孢子接種法 即以叢枝菌根真菌的孢子作為接種物進行接種處理，是常用的接種方法。可先將孢子從菌劑中分離出來，挑到濾紙上或放進盛有生理鹽水的小瓶中，便可用來接種。如果菌劑中只含有孢子，可根據單位重量或單位體積孢子含量直接加入一定重量或體積的菌劑。按孢子用量又可進一步分為：(1)單孢接種 即只挑一個孢子用來接種。通常用于菌種純化、分離、分類鑒定等研究目的。事先在滅菌沙中播種煙草等寄主植物，培養至3—6片真葉，即可用于接種處理。解剖鏡下用毛細管把孢子直接放在幼苗根系上，然后將該苗定植于育苗器中，采用半水培法培養2—4周后一般即有菌根侵染。(2)雙孢接種 挑出兩個相似的孢子接種，類似于單孢接，但接種成功的機會大于單孢接種法。(3)多孢接種 即挑選外部形態一致的3個或多個孢

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子進行接種。可以大大提高接種成功的機會。但有時所接孢子可能不是來自一個種，因此，該法不宜用來菌種純化、分離鑒定等工作。但可用于生理效應、生態等研究工作，如一般每棵幼苗可接500—1000個孢子。2．根段接種法 將已充分形成菌根的根段(侵染率達80％以上，且含有較多泡囊)，剪成小碎段，可用作接種物。一般每個營養缽接種0．2—0．5g新鮮根段即可。無論新鮮或風干的根段，均可測定出接種勢單位數量。根據需要的接種勢單位數量，換算成根段長度或重量，即可接種。3．培養基質接種法

是最常用的叢枝菌根真菌的接種方法。由于用石英砂、純凈的河沙、蛭石、沙土等作培養基質來繁殖菌種。因此，這些培養基質中含有大量孢子、菌絲、菌根根段或(和)孢子果等繁殖體，其接種勢較大，且新鮮的接種物優于風干的。用此培養基質接種物作菌劑，侵染成功率高、速度快。具體操作上可依上述方法測得單位重量或體積培養基質接種物的接種勢單位數量。一般每個營養缽或每盆可分別參考施用5000或10 000接種勢單位；對于苗圃或大田可按每m2為5X10*一5X10’接種勢單位的菌劑進行接種。二、按接種部位區分的接種方法1．對種子接種 是播種時或播種前對種子進行的接種處理。根據不同處理方式，又可將其分為：①種子球衣化接種法：種子球衣化是生產上常用的方法，大體作法是將接種物、粘合劑與種子一起經過球衣機加工，使種子表面包圍一層均勻的接種劑，涼干后便可播種。此法成本較高。②拌種接種法：將接種劑與種子拌勻后再播種。2．對幼苗根系接種 對各種來源的組培苗、脫毒苗、少于6片真葉的生長在滅菌基質中的幼苗，均可將接種劑直接放到根系上或根系周圍。此法菌根侵染速度較快，如果用新鮮的菌劑則侵染速度會更快。3．對容器接種 當前越來越多的經濟作物采用各種容器育苗，如紙質或塑膜營養缽、各種育苗器、花盆等均常用來短期培育或栽培植物。可將菌劑與滅菌后的培養基質混勻、裝入容器，然后播種或定植幼苗。也可先將滅菌后的培養基質裝入營養缽或育苗器中，在培養基質上挖數個小穴，將接種劑放人穴內；或將接種劑放在容器中部，然后在培養基質表面播種。此法的特點是因容器體積限定了根系的擴展范圍，同時由于菌劑比較集中，故有利于強迫侵染，可以培育出優質菌根苗，當其侵染率達50％以上時，便可移栽到苗圃或大田中。4。對苗床和苗圃接種 在苗床或苗圃基質或土壤上開溝，然后將接種劑條播到溝內，最后播種。5．對大田接種 開溝后可將接種劑撒播到溝內，然后再播種，這樣可以減少接種劑用量。如地表撒播，然后耙入土內，接種物用量較多。國外已有用飛機撒播接種物，這在飛播造林上是常用的方法。三、其他接種方法1．大田直接定植營養缽接種法 將菌劑加入營養缽并播種后，直接將其按一定株行距定植到大田中。這樣可以省去營養缽育苗過

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程。由于菌劑被限制在營養缽內，可以大大提高侵染速率和侵染強度，從而增強接種菌根真菌的效果。2。多菌混合接種法 所謂多菌混合接種法是指同時將兩種或兩種以上叢枝菌根真菌的接種劑，施加到要進行接種處理的土壤或植物上；有時也指將叢枝菌根真菌與外生菌根真菌、根瘤菌、解磷或解鉀細菌、其他生防細菌或真菌等同時混合接種，這是科研上針對不同試驗目的采用的方法。3。覆蓋作物接種法 即幼齡果園一般間作花生、大豆、地瓜、三葉草、玉米、小麥等。這些間作物都適合于叢枝菌根真菌的侵染。因此，在果園間作作物播種同時接種菌根，生長一定階段后，可增加土壤中叢枝菌根真菌的數量，減少土壤中病原物的數量，從而改善新建果園土壤中微生物區系組成和土壤健康狀況。作物收獲后大部分根系保留于土壤中，由于這些根系都形成了大量的菌根，存留在果園土壤中可作為下一年的接種物。另外，先在苗床或苗圃上種植菌根苗，第二年在這些苗木周圍再定植上幼苗。由于它們的根系在土壤中交錯，這些小苗的根系受母苗菌根真菌的感染而形成菌根。此法可靠而簡便，但幼苗菌根形成時間較慢。小 結以上僅簡要介紹了與叢枝菌根真菌應用相關的部分常用技術和方法。如需詳細了解某一技術方法，可從文后找到所附參考資料。不難預見，隨著現代科學技術的研究和發展，必將大大推動菌根研究和應用開發工作。因此，上述應用技術會得到不斷改進，新技術亦會脫穎而出。菌根生物技術及其相關配套技術將在21世紀逐漸走向成熟與完善。

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