濕篩傾析法

2023年12月21日發(fā)(作者：一什么雪)

真菌分離方法

11112 培養(yǎng)基

PDA綜合培養(yǎng)基:馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊

脂20g, KH2

PO4

3 g,MgSO4

1. 5g,蒸餾水1000ml, pH

自然。

促孢培養(yǎng)基:蔗糖1g,瓊脂5g,酵母浸膏011g,

KH2

PO4

011g,蒸餾水1000ml, pH自然。

112 試驗(yàn)方法

11211 土壤含水量測(cè)定

用分析天平稱取各土樣10g,用干燥鐵盒裝好,放入干燥烘干箱烘干,調(diào)至105℃烘干8h,然后置于干燥器中,待冷卻后取出用分析天平稱量,計(jì)算土壤含水量。

土壤含水量= [ (10g - 烘干后質(zhì)量) /10g ] ×100%。

11212 土樣中真菌的分離

采用稀釋平板法進(jìn)行真菌分離[ 2 ]

,稱取10g新鮮土樣,加入盛有90ml無菌水的三角瓶中,放在搖床上(120～200 r /min)振蕩10min～20min,使土樣均勻分散在稀釋液中成為土壤懸浮液。再用移液器移取10mL的土壤懸浮液,加入盛有90ml無菌水的三角瓶中充分震蕩,至此土壤已被稀釋至10- 2倍。移取1mL土壤懸液滴于9cm直徑的滅菌培養(yǎng)皿中,然后倒入15ml即將凝固的PDA

培養(yǎng)基( 40℃左右) ,并與土壤懸液混合均勻,待凝固后置于25℃恒溫箱中培養(yǎng),每種土樣處理5個(gè)重復(fù)。

11213 菌種純化

在培養(yǎng)過程中,當(dāng)組織材料周圍生出明顯菌絲時(shí),采用尖端挑取法挑取形態(tài)不同的菌落, 轉(zhuǎn)入

PDA斜面培養(yǎng)基上, 25℃恒溫條件下純化培養(yǎng)。

11214 真菌的鑒定

對(duì)于已產(chǎn)生孢子的菌落直接挑取進(jìn)行鑒定,通過水載片,觀察孢子梗、孢子的形態(tài)、大小,結(jié)合培養(yǎng)特性、子囊殼及菌絲的特征,參考相關(guān)資料進(jìn)行鑒定[ 3～5 ]

。未長(zhǎng)出孢子的真菌接入促孢培養(yǎng)基,待孢子形成后鑒定。

濕篩傾析法

① 將采集的土壤樣品分別混勻，稱取100g放入容器中，用清水浸泡20~30min。

② 過篩：用孔徑800um~55um潔凈的土壤篩分層重疊放置，小孔徑在最底層，并使篩面適當(dāng)傾斜。

③ 用玻璃棒攪拌土壤浸泡液，停放后待大的石礫或雜物沉積在容器底部，將上層的土壤懸浮液慢慢地倒入最上一層的土壤篩內(nèi)，最好集中在一小范圍內(nèi)傾倒，以保證篩出的孢子盡量集中，減少損失。

④ 用清水繼續(xù)沖洗各篩面的篩出物，直至沒有土壤微粒為止。

⑤ 用清潔的洗瓶分別將各篩面上滯留的篩出物輕輕地洗入潔凈的培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)皿內(nèi)的篩出物除了有相應(yīng)孔徑的沙粒和雜物外，就是不同直徑的VA菌根菌的孢子。

⑥ 將含有篩出物的培養(yǎng)皿放在雙目解剖鏡下觀察。用吸管分別將相同形態(tài)的孢子，逐個(gè)移入小玻璃瓶?jī)?nèi)，或放在濾紙上。

密度梯度離心法

在離心管中配制由蔗糖、甘油等不同密度媒質(zhì)溶液組成的不同濃度的梯度柱，隨著離心力的作用，使不同比重的VA菌根菌的孢子分別析離在不同的梯度濃度的界面上，從而達(dá)到分離出不同孢子的目的。

①~③步驟完全與濕篩傾析法相同；

④ 將用清水沖洗的篩出物，裝入離心管內(nèi)，加水至1/2處離心。⑤ 除去水面雜物及上清液，有時(shí)上清液中含有較輕的孢子，應(yīng)先檢查后再棄。保留下部沉淀物，加2mol的蔗糖溶液至離心管的1/2，再離心1~2min。

⑥ 離心后VA菌的孢子多浮于液體表面。因此，可分別將上清液倒入放有濾紙的最小孔徑的篩網(wǎng)上，用清水仔細(xì)沖洗糖液，即可獲得不同直徑的孢子。