妊娠相關血漿蛋白A的原核表達及蛋白純化

2024年2月6日發(作者：疫情短語)

妊娠相關血漿蛋白A的原核表達及蛋白純化

曾昭偉;常艷敏;王學謙

【摘 要】目的 構建原核表達PAPP-A重組蛋白,并對蛋白質進行純化.方法 根據DNAstar軟件分析獲得的編碼PAPP-A特異抗原表位,利用Primer Premier 5.0軟件設計引物,以PAPP-A cDNA-質粒轉化菌液為模板,進行PCR擴增.PAPP-A的DNA和pET42a質粒分別雙酶切,經瓊脂糖凝膠電泳及膠回收后進行連接反應,轉化至大腸埃希菌Top10,篩選陽性克隆經測序鑒定正確后,轉化至大腸埃希菌BL21,誘導產生PAPP-A重組蛋白,利用鎳柱初步純化及離子交換層析柱進一步純化,用SDS-PAGE及DEAE層析鑒定重組抗原蛋白.結果 篩選出抗原表位集中區,在大腸埃希菌BL21中高效表達了重組的PAPP-A蛋白,經過鎳柱及離子交換層析純化后,PAPP-A濃度為0.22 g/L,DEAE層析分析證實其純度較高.結論 成功篩選出PAPP-A的抗原表位集中區,并制備了重組抗原蛋白,為PAPP-A的后續臨床研究提供依據.

【期刊名稱】《臨床檢驗雜志》

【年(卷),期】2016(034)003

【總頁數】4頁(P186-189)

【關鍵詞】妊娠相關血漿蛋白A;抗原表位;原核表達

【作 者】曾昭偉;常艷敏;王學謙

【作者單位】天津市南開醫院檢驗科,天津300100;天津市南開醫院檢驗科,天津300100;天津市南開醫院檢驗科,天津300100

【正文語種】中 文

【中圖分類】R392-33

妊娠相關蛋白A(pregnancy-associated plasma proteinA，PAPP-A) 是一種大分子糖蛋白，分子量(Mr)約為500×103，目前證實2個相同PAPP-A亞基與2個嗜酸主要堿性蛋白前體(proMBP)通過二硫鍵比例形成PAPP-A/proMBP化合物[1]。 proMBP是PAPP-A的內源性抑制劑[2]，可在胎盤合體滋養層和蛻膜生成、分泌。PAPP-A也存在于非孕婦的非胎盤組織、細胞中，如成骨細胞[3]、成纖維細胞[4]等。PAPP-A在急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者的外周血中呈高表達，對ACS的早期診斷及預測具有重要的價值[5]。目前對其的免疫學檢測主要有酶聯免疫、放射免疫及發光免疫檢測。其中， ELISA法檢測應用較廣，目前急迫的是如何提高ELISA法的敏感性、特異性，使PAPP-A檢測在臨床上得到更廣泛的應用。本研究擬通過去除proMBP干擾，得到活性更高的PAPP-A蛋白，建立敏感性較高的克隆和重組PAPP-A蛋白的檢測方法，并純化重組蛋白制備抗體，為PAPP-A在ACS中的檢測和機制研究提供實驗依據。

1.1 材料 pET42a質粒、大腸埃希菌Top10菌株和BL21菌株均購自北京全式金公司；PAPP-A cDNA-質粒轉化菌液購自美國Thermo公司。Trizol、2×EasyTaq PCR SuperMix、DNA Marker、Placenta cDNA、GAPDH購自北京康為世紀公司；Fastpfu、IPTG、X-gal、LB培養基各組分(胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉)、質粒小提試劑盒、鎳柱、RNA酶抑制物購自北京全式金公司；HindⅢ限制性內切酶、EcoRI限制性內切酶、T4 DNA Liga購自TaKaRa公司；DNA瓊脂凝膠回收試劑盒購自Solarbio公司；長片段PCR試劑盒購自Fermentas公司；MMuLV逆轉錄酶購自Promega公司；丙烯酰胺(Acr)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)

購自北京鼎國公司。SDS-PAGE試劑購自北京中山公司。Anke-GL-20G-H型離心機購自上海安亭科學儀器廠；紫外分光光度計購自上海儀器廠；HD-1B數顯恒流泵、HD-A電腦采集器、HD-3紫外檢測儀均購自上海滬西分析儀器公司；DYCZ-24EN型雙垂直電泳槽購自北京市六一儀器廠；離子交換層析柱(2.6

cm×40 cm)購自瑞典Pharmacia公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的獲取、擴增 根據DNAstar軟件分析得到的編碼PAPP-A特異抗原表位，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物，在上、下游引物的5′及3′端分別加入保護堿基AT及A和粘性酶切位點。上游引物P1：5′-ATAAGCTTATGCGGCTCTGGA

GTTG-3′，下游引物P2：5′-AGAATTCGCAGCACCCA

ACTCCAG-3′ (其中下劃線部分分別為HindⅢ及EcoRⅠ酶切位點)，由上海生工公司合成。以PAPP-A的cDNA-質粒轉化菌液為模板(原液、1∶10稀釋、1∶50稀釋)進行PCR擴增，PCR循環參數：5×PCR反應緩沖液5 μL，2.5 mmol/L

dNTP 2.5 μL，0.01 mmol/L 上、下游引物各1 μL，0.5 μg cDNA-質粒模板4

μL，5×106 U/L 高保真Pfu Polymera 1 μL，2.0 mmol/L Mg2+0.5 μL，PCR

Stimulan 0.5 μL，ddH2O補足至25 μL。循環參數：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃延伸5 min。PCR產物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像分析系統下觀察鑒定產物片段大小，并按照回收試劑盒說明書操作回收目的DNA。

1.2.2 制備重組質粒 將回收目的DNA和質粒載體pET42a分別用2個對應酶切位點的限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ切割，酶切體系包括：目的DNA片段1

μg，HindⅢ和EcoRⅠ限制性內切酶各1 μL，10×H Buffer 2 μL，ddH2O 8 μL。37 ℃溫育4 h后，PAPP-A編碼特異目的DNA用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定并

按1.2.1步驟作回收凝膠中的目的DNA。質粒載體片段用同樣方法經7 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并從凝膠中回收特異酶切目的DNA。連接反應體系：0.08

μmol/L目的片段5 μL，0.04 μmol/L pET42a質粒1 μL， T4 DNA連接酶1 μL。置于16 ℃粘性連接過夜。轉化至感受態大腸埃希菌Top10，在含Amp抗性的LB固體培養基平板上37 ℃培養過夜，并用1.2.1中PCR方法鑒定陽性重組子。用無菌牙簽挑取陽性單克隆菌落至含Kan抗性LB培養液的菌種管，37 ℃、300

r/min振蕩培養過夜，取部分菌液送上海英駿公司進行測序反應，另一部分菌液按照小量質粒制備試劑盒說明書操作提取質粒，并用內切酶進行雙酶切鑒定。

1.2.3 融合蛋白的初步純化與洗脫 取測序正確的含上述重組質粒轉化大腸埃希菌BL21，在含Amp抗性的LB固體培養基平板上進行篩選陽性克隆。陽性克隆接種LB液體培養基，37 ℃振蕩培養至吸光度(A600 nm)為0.6時，經0.1 mmol/L丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，37 ℃溫育4 h。同時選擇少量未誘導的陽性克隆作為陰性對照。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集菌體，沉淀經過超聲波破碎，再行8 000 r/min離心10 min，上清和沉淀分別進行SDS-PAGE[6]，用包涵體洗滌液洗滌3次，每次5 min。10 000 r/min離心10 min，收集沉淀，在包涵體洗滌液中加入2 mol/L尿素重懸沉淀，16 ℃輕搖5 min，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀。沉淀用8 mol/L尿素溶解包涵體，12 000 r/min離心10

min，收集上清得到蛋白質粗制品。粗制品過0.22 μm濾膜，再將上述蛋白質樣品過鎳柱層析，分別用50、250、500 mmol/L咪唑洗脫緩沖液濃度梯度洗脫目的蛋白，行初步純化。

1.2.4 DEAE層析純化 用DEAE A-50凝膠柱裝柱，以0.01 mol/L Tris-HCl(pH

7.2)沖洗平衡后，鎳柱粗提蛋白質樣品上樣，濃度梯度洗脫(NaCl濃度依次為0.15

mol/L、0.30 mol/L、0.45 mol/L)，收集體積為每管1 mL，收集的蛋白質組分以雙抗體夾心ELISA法[7]檢測活性以確定有PAPP-A活 性的洗脫峰。紫外分光光度

計檢測其吸光度(A260 nm、A280 nm值)，按照公式：蛋白質濃度(g/L)=1.45×A280 nm-0.74×A260 nm鑒定的蛋白質濃度。將收集目的蛋白濃縮至2 mL，4 ℃保存。

2.1 PAPP-A cDNA質粒PCR結果 PAPP-A cDNA連接的質粒菌液測序后并未發生突變，PCR分析發現，在約309 bp處有特異條帶，表明此條帶是編碼抗原表位的最強決定簇所在位置，cDNA原液及cDNA 1∶10稀釋的條帶明顯。見圖1。

2.2 pET42a質粒雙酶切結果 質粒載體pET42a經HindⅢ、EcoRⅠ內切酶酶切后，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，條帶清晰單一，證明pET42a質粒純度以及濃度均達到要求。見圖2。

2.3 誘導表達PAPP-A重組蛋白 通過PCR、酶切以及測序鑒定連接正確的重組質粒誘導表達PAPP-A重組蛋白，同時以未誘導的作為對照行SDS-PAGE分析。結果見圖3。

2.4 目的蛋白經DEAE離子層析純化 上述初步純化處理的重組PAPP-A高活性蛋白混合濃縮液經DEAE A-50離子交換層析后分離效果。結果見圖4。

2.5 目的蛋白質濃度 PAPP-A重組蛋白純化后檢測A260 nm=0.14、A280

nm=0.54，經計算PAPP-A蛋白濃度為0.22 g/L。

本實驗室前期研究PAPP-A在孕婦產前篩查中的臨床應用時，利用ELISA試劑盒檢測孕婦血清中PAPP-A蛋白，取得了較為理想的結果。但結合部分文獻及前期實驗，認為檢測孕婦血清中PAPP-A的ELISA檢測體系并不適用于檢測ACS患者血清PAPP-A檢測。原因：(1)ACS患者血清PAPP-A含量極低，故ELISA試劑盒難以檢測；(2)孕婦血清中PAPP-A與proMBP以2∶2比例結合，在ACS患者血清PAPP-A不與proMBP結合，所以兩者檢測的目的蛋白可能有差異。有研究把PAPP-A/proMBP作為復合物進行檢測[8]，結果顯示復合物濃度與ACS斑塊發展

有良好相關性，然而，Qin等[9]認為迄今為止臨床研究中多利用PAPP-A/proMBP作為復合物檢測ACS，但是這并非最優方法。所以，排除proMBP的干擾，建立檢測PAPP-A蛋白的方法值得研究。據此本研究設計、篩選出PAPP-A特異表位，以PAPP-A的cDNA-質粒轉化菌液為模板，PCR結果表明，目的蛋白位置在309 bp處。且作為載體的pET42a質粒純度以及濃度均達到要求，表明本實驗成功轉化制備PAPP-A重組蛋白，電泳結果顯示誘導菌液有目的條帶，未誘導菌液則條帶呈陰性。

本研究針對抗原決定簇集中的位置，克隆重組制備出PAPP-A重組抗原蛋白，以此為抗原制備的抗體，在后續超敏檢測體系的建立中有效排除非proMBP及特異表位的干擾。但制備的重組PAPP-A抗原經過鎳柱初步純化并經SDS-PAGE鑒定，發現仍有大量雜質雜質。PAPP-A等電點(pI)為4.4～4.6，在緩沖液pH 7.2時帶負電，與陰離子交換介質具有較強的親和作用，因此將PAPP-A經離子柱層析純化后，第一峰1～3組分為雜質蛋白，第二峰4～6組分為目的重組蛋白，有效去除雜質蛋白，表明離子交換層析是一種重要的純化蛋白方式[10]。

本研究通過DNAstar分析找出感興趣的特異編碼抗原表位的區域克隆擴增，克隆片段的長度易于PCR，篩選出PAPP-A特異表位并以此制備重組PAPP-A在臨床檢驗中檢測中排除proMBP及非特異表位的干擾增強了特異性，下一步再研究提高PAPP-A檢測敏感性使PAPP-A臨床檢測應用得到進一步的發展。

【相關文獻】

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