大麗輪枝菌致病機(jī)理及相關(guān)致病基因研究進(jìn)展

2024年2月14日發(fā)(作者：耳朵英文怎么讀)

大麗輪枝菌致病機(jī)理及相關(guān)致病基因研究進(jìn)展

作者：金利容 黃薇 楊妮娜 尹海辰 萬(wàn)鵬

來(lái)源：《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》2021年第10期

摘要 大麗輪枝菌是農(nóng)作物上為害最嚴(yán)重的土傳病原物之一，對(duì)于該病原物引起的病害目前仍缺乏有效的防控手段，而明確其致病機(jī)理被認(rèn)為是開(kāi)發(fā)新型藥劑和防治技術(shù)的理論基礎(chǔ)。綜述了大麗輪枝菌的侵染過(guò)程、植物細(xì)胞壁的降解、微菌核和黑色素的形成等一些重要的生理過(guò)程相關(guān)的致病基因，并總結(jié)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因、毒力蛋白基因、效應(yīng)因子、無(wú)毒基因和激發(fā)子等多方面致病相關(guān)基因的研究結(jié)果，最后概述了篩選致病基因和研究基因功能的方法。

關(guān)鍵詞 大麗輪枝菌;致病機(jī)理;致病基因

中圖分類號(hào) S435.621.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2021）10-0015-05

doi：10.3969/.0517-6611.2021.10.005

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Rearch Progress on the Pathogenesis and Pathogenic Related Genes of Verticillium dahliae

JIN Li-rong， HUANG Wei， YANG Ni-na et al

（Key Laboratory of Integrated Management of Crop Pests in Central China， Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， Institute of Plant Protection， Soil and Fertilizer， Hubei Academy

of Agricultural Sciences，Wuhan，Hubei 430064）

Abstract Verticillium dahliae was one of the most destructive soil-borne pathogens in crop plants.

There was no effective method to control the dias caud by V. dahliae. The studies on its

pathogenic mechanism were thought as the theoretical basis to develop new pesticides and control

techniques. This article reviewed some pathogenic genes related with some important physiological

process such as the process of infection， the degradation of plant cell walls and the formation of

microsclerotia and melanin. The rearch results of multiple pathogenic genes such as transcriptional

regulatory genes， virulence protein genes， effector genes， avirulence genes and elicitors were

summarized. The strategies of screening the pathogenic genes and rearching the functions of the

genes were summarized.

Key words Verticillium dahliae;Pathogenesis;Pathogenic genes

大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）隸屬半知菌類絲孢綱絲孢目叢梗孢科輪枝菌屬。大麗輪枝菌是一種通過(guò)土壤傳播的植物病原真菌，病原菌能夠定殖在植物維管束內(nèi)，引起植物的萎蔫癥狀。大麗輪枝菌在世界范圍內(nèi)均有分布，且寄主范圍廣泛，可侵染660多種植物，包括經(jīng)濟(jì)作物（如棉花、茄子、番茄、西瓜等）及糧食作物（如馬鈴薯等），對(duì)農(nóng)作物的生產(chǎn)可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。大麗輪枝菌侵染寄主后會(huì)引起萎蔫癥狀，俗稱黃萎病。大麗輪枝菌引起的病害較難控制的一個(gè)重要原因在于其能夠形成微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核可以在土壤中長(zhǎng)期存活，且其抵御外界逆境的能力強(qiáng)。因此，科學(xué)家試圖通過(guò)研究病原菌致病的分子機(jī)制和信號(hào)通路，尋找病害防治的新策略。隨著研究的不斷深入，近幾年大量文獻(xiàn)報(bào)道了大麗輪枝菌致病的相關(guān)基因，試圖闡述其致病的分子機(jī)理。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，2008年美國(guó)Broad研究所完成了從萵苣中分離出來(lái)的大麗輪枝菌VdLs.17菌株的全基因組測(cè)序工作，整個(gè)基因組大小為33.8 Mb，編碼10 535個(gè)蛋白。測(cè)序工作為致病相關(guān)基因的研究提供了更好的平臺(tái)。

筆者對(duì)國(guó)內(nèi)外關(guān)于大麗輪枝菌的致病機(jī)理及相關(guān)致病基因的研究進(jìn)行了綜述，以期為更好地防治此類病害提供理論依據(jù)。

1 大麗輪枝菌的致病基因

1.1 大麗輪枝菌侵染過(guò)程相關(guān)的致病基因

研究者們利用熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)對(duì)大麗輪枝菌菌株進(jìn)行標(biāo)記，并觀察和記

錄大麗輪枝菌對(duì)寄主植物的侵染過(guò)程。以棉花和擬南芥為研究對(duì)象，當(dāng)大麗輪枝菌接種到寄主植物的根部，2～ 6 h后分生孢子吸附在根的表面，并隨機(jī)分布在寄主的主根或側(cè)根;12 h后，部分分生孢子萌發(fā)，形成芽管和菌絲;2 d后，大量菌絲包裹在根部表面并進(jìn)入根部組織，在根部組織內(nèi)縱向和橫向擴(kuò)展;5 d后，菌絲在縱向延伸時(shí)快速增殖，同時(shí)菌絲向維管組織中擴(kuò)展，并在木質(zhì)部中形成一個(gè)菌絲網(wǎng)[1]。10 d后，菌絲沿木質(zhì)部導(dǎo)管向上延伸到地上組織，并到達(dá)側(cè)枝部分;12 d后，菌絲向根尖區(qū)域延伸，導(dǎo)致根冠塌陷;14 d后，根部菌絲減少，地上部分開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫癥狀[2]。

整個(gè)侵染過(guò)程涉及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會(huì)形成附著枝和侵染釘。其中，2個(gè)基因VdNoxB和VdPls1被證實(shí)在侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程發(fā)揮重要作用，VdNoxB編碼一個(gè)膜結(jié)合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個(gè)四跨膜蛋白，它們形成復(fù)合物，共同定位于附著枝基部。復(fù)合物VdNoxB/VdPls1通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子Crz1介導(dǎo)的信號(hào)途徑，最終促進(jìn)侵染釘?shù)男纬蒣3]。當(dāng)2個(gè)基因分別缺失時(shí)，侵染釘便不能形成，導(dǎo)致菌株的致病力下降。侵染釘衍生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開(kāi)，形成一個(gè)病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效應(yīng)蛋白）以及一些信號(hào)分子通過(guò)囊泡運(yùn)輸和胞吐作用被輸送到這個(gè)侵染界面，形成蛋白環(huán)。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過(guò)程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵

染界面的傳輸，導(dǎo)致菌株毒力的下降。在菌株對(duì)根部的感染過(guò)程中，菌絲頸是一個(gè)重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過(guò)抑制和逃避寄主植物的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主的成功感染[4]。

1.2 細(xì)胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會(huì)分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細(xì)胞壁降解酶（CWDE），細(xì)胞壁降解酶通過(guò)降解寄主的細(xì)胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準(zhǔn)備。CWDE可分為果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數(shù)量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時(shí)間內(nèi)掃除植物體內(nèi)一些果膠物質(zhì)的障礙，進(jìn)而完成在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的定殖和擴(kuò)散，同時(shí)不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細(xì)胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產(chǎn)生的果膠，其降解產(chǎn)物還可以作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[6]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個(gè)PL1家族的果膠裂解酶和10個(gè)GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時(shí)，不同果膠酶對(duì)病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對(duì)致病力并沒(méi)有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質(zhì)酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物的防御反應(yīng)，2個(gè)基因的缺失均能夠?qū)е戮闢d991在棉花寄主上的毒力顯著降低。內(nèi)切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEg-1對(duì)于早期的侵染定殖至關(guān)重要，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是一種重要的細(xì)胞壁降解酶，研究證實(shí)VdSSP1的缺失能夠降低其對(duì)果膠和淀粉的利用率以及對(duì)棉花的致病力[11]。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶VdSNF1（sucro non-fermenting protein kina 1，SNF1）是細(xì)胞壁水解酶上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，主要參與糖類信號(hào)和真菌發(fā)育信號(hào)的傳遞。該基因的缺失導(dǎo)致病原菌對(duì)果膠和半乳糖的利用能力受到嚴(yán)重影響，且可以引起番茄寄主的致病力下降達(dá)到87%，在寄主植物維管束內(nèi)不能成功定殖[12]。幾丁質(zhì)酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應(yīng)和防御反應(yīng)以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[13]。

細(xì)胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒(méi)有同源關(guān)系的基因編碼的多肽，除了包含一些關(guān)鍵基因，也包含一些功能重復(fù)的基因，多個(gè)基因之間相互調(diào)控，共同參與了真菌生物學(xué)毒性的產(chǎn)生過(guò)程，因此在缺失功能上冗余的其中一個(gè)基因后并不會(huì)產(chǎn)生致病力的變化，但一些關(guān)鍵基因的缺失還是會(huì)導(dǎo)致毒力的顯著下降或喪失。總體而言，細(xì)胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細(xì)胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關(guān)的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核能夠在土壤中存活數(shù)10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環(huán)境。微菌核是自然界最初的侵染源，當(dāng)外界自然環(huán)境適宜時(shí)植物的根系分泌物會(huì)誘導(dǎo)微菌核萌發(fā)形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內(nèi)。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關(guān)。

絲狀真菌會(huì)分泌包含8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)域（約100個(gè)氨基酸）的小分子量蛋白質(zhì)，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結(jié)構(gòu)的形成和有性生殖等很多方面都發(fā)揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產(chǎn)微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環(huán)境的能力降低，但致病性并沒(méi)有明顯變化。相對(duì)于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達(dá)量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長(zhǎng)期存活有關(guān)。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關(guān)的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產(chǎn)生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)下調(diào)，但疏水蛋白基因VDH1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產(chǎn)生受到顯著抑制，產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，其突變體也能夠形成微菌核，說(shuō)明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測(cè)VdGARP1在微菌核的初始形成階段發(fā)揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個(gè)促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉(zhuǎn)錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調(diào)節(jié)一些黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)大麗輪枝菌對(duì)紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會(huì)影響乙烯合成、黑色素形成和致病性等相關(guān)基因的表達(dá)，其突變株可以產(chǎn)生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關(guān)基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢能力下降，微菌核的產(chǎn)生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個(gè)多功能基因，參與了菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學(xué)功能[20]。

整個(gè)侵染過(guò)程涉及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會(huì)形成附著枝和侵染釘。其中，2個(gè)基因VdNoxB和VdPls1被證實(shí)在侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程發(fā)揮重要作用，VdNoxB編碼一個(gè)膜結(jié)合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個(gè)四跨膜蛋白，它們形成復(fù)合物，共同定位于附著枝基部。復(fù)合物VdNoxB/VdPls1通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子Crz1介導(dǎo)的信號(hào)途徑，最終促進(jìn)侵染釘?shù)男纬蒣3]。當(dāng)2個(gè)基因分別缺失時(shí)，侵染釘便不能形成，導(dǎo)致菌株的致病力下降。侵染釘衍生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開(kāi)，形成一個(gè)病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白

（如毒力蛋白、效應(yīng)蛋白）以及一些信號(hào)分子通過(guò)囊泡運(yùn)輸和胞吐作用被輸送到這個(gè)侵染界面，形成蛋白環(huán)。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過(guò)程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵染界面的傳輸，導(dǎo)致菌株毒力的下降。在菌株對(duì)根部的感染過(guò)程中，菌絲頸是一個(gè)重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過(guò)抑制和逃避寄主植物的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主的成功感染[4]。

1.2 細(xì)胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會(huì)分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細(xì)胞壁降解酶（CWDE），細(xì)胞壁降解酶通過(guò)降解寄主的細(xì)胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準(zhǔn)備。CWDE可分為果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數(shù)量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時(shí)間內(nèi)掃除植物體內(nèi)一些果膠物質(zhì)的障礙，進(jìn)而完成在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的定殖和擴(kuò)散，同時(shí)不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細(xì)胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產(chǎn)生的果膠，其降解產(chǎn)物還可以作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[6]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個(gè)PL1家族的果膠裂解酶和10個(gè)GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時(shí)，不同果膠酶對(duì)病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對(duì)致病力并沒(méi)有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質(zhì)酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物的防御反應(yīng)，2個(gè)基因的缺失均能夠?qū)е戮闢d991在棉花寄主上的毒力顯著降低。內(nèi)切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEg-1對(duì)于早期的侵染定殖至關(guān)重要，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是一種重要的細(xì)胞壁降解酶，研究證實(shí)VdSSP1的缺失能夠降低其對(duì)果膠和淀粉的利用率以及對(duì)棉花的致病力[11]。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶VdSNF1（sucro non-fermenting protein kina 1，SNF1）是細(xì)胞壁水解酶上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，主要參與糖類信號(hào)和真菌發(fā)育信號(hào)的傳遞。該基因的缺失導(dǎo)致病原菌對(duì)果膠和半乳糖的利用能力受到嚴(yán)重影響，且可以引起番茄寄主的致病力下降達(dá)到87%，在寄主植物維管束內(nèi)不能成功定殖[12]。幾丁質(zhì)酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應(yīng)和防御反應(yīng)以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[13]。

細(xì)胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒(méi)有同源關(guān)系的基因編碼的多肽，除了包含一些關(guān)鍵基因，也包含一些功能重復(fù)的基因，多個(gè)基因之間相互調(diào)控，共同參與了真菌生物學(xué)毒性的產(chǎn)生過(guò)程，因此在缺失功能上冗余的其中一個(gè)基因后并不會(huì)產(chǎn)生致病力的變化，但一些關(guān)鍵基因的缺失還是會(huì)導(dǎo)致毒力的顯著下降或喪失。總體而言，細(xì)胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細(xì)胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關(guān)的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核能夠在土壤中存活數(shù)10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環(huán)境。微菌核是自然界最初的侵染源，當(dāng)外界自然環(huán)境適宜時(shí)植物的根系分泌物會(huì)誘導(dǎo)微菌核萌發(fā)形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內(nèi)。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關(guān)。

絲狀真菌會(huì)分泌包含8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)域（約100個(gè)氨基酸）的小分子量蛋白質(zhì)，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結(jié)構(gòu)的形成和有性生殖等很多方面都發(fā)揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產(chǎn)微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環(huán)境的能力降低，但致病性并沒(méi)有明顯變化。相對(duì)于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達(dá)量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長(zhǎng)期存活有關(guān)。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關(guān)的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產(chǎn)生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)下調(diào)，但疏水蛋白基因VDH1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產(chǎn)生受到顯著抑制，產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，其突變體也能夠形成微菌核，說(shuō)明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測(cè)VdGARP1在微菌核的初始形成階段發(fā)揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個(gè)促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉(zhuǎn)錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調(diào)節(jié)一些黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)大麗輪枝菌對(duì)紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會(huì)影響乙烯合成、黑色素形成和致病性等相關(guān)基因的表達(dá)，其突變株可以產(chǎn)生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關(guān)基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢能力下降，微菌核的產(chǎn)生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個(gè)多功能基因，參與了菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學(xué)功能[20]。

整個(gè)侵染過(guò)程涉及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會(huì)形成附著枝和侵染釘。其中，2個(gè)基因VdNoxB和VdPls1被證實(shí)在侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程發(fā)揮重要作用，VdNoxB編碼一個(gè)膜結(jié)合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個(gè)四跨膜蛋白，它們形成復(fù)合物，共同定位于附著枝基部。復(fù)合物VdNoxB/VdPls1通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子Crz1介導(dǎo)的信號(hào)途徑，最終促進(jìn)侵染釘?shù)男纬蒣3]。當(dāng)2個(gè)基因分別缺失時(shí)，侵染釘便不能形成，導(dǎo)致菌株的致病力下降。侵染釘衍

生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開(kāi)，形成一個(gè)病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效應(yīng)蛋白）以及一些信號(hào)分子通過(guò)囊泡運(yùn)輸和胞吐作用被輸送到這個(gè)侵染界面，形成蛋白環(huán)。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過(guò)程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵染界面的傳輸，導(dǎo)致菌株毒力的下降。在菌株對(duì)根部的感染過(guò)程中，菌絲頸是一個(gè)重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過(guò)抑制和逃避寄主植物的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主的成功感染[4]。

1.2 細(xì)胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會(huì)分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細(xì)胞壁降解酶（CWDE），細(xì)胞壁降解酶通過(guò)降解寄主的細(xì)胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準(zhǔn)備。CWDE可分為果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數(shù)量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時(shí)間內(nèi)掃除植物體內(nèi)一些果膠物質(zhì)的障礙，進(jìn)而完成在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的定殖和擴(kuò)散，同時(shí)不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細(xì)胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產(chǎn)生的果膠，其降解產(chǎn)物還可以作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[6]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個(gè)PL1家族的果膠裂解酶和10個(gè)GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時(shí)，不同果膠酶對(duì)病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對(duì)致病力并沒(méi)有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質(zhì)酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物的防御反應(yīng)，2個(gè)基因的缺失均能夠?qū)е戮闢d991在棉花寄主上的毒力顯著降低。內(nèi)切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEg-1對(duì)于早期的侵染定殖至關(guān)重要，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是一種重要的細(xì)胞壁降解酶，研究證實(shí)VdSSP1的缺失能夠降低其對(duì)果膠和淀粉的利用率以及對(duì)棉花的致病力[11]。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶VdSNF1（sucro non-fermenting protein kina 1，SNF1）是細(xì)胞壁水解酶上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，主要參與糖類信號(hào)和真菌發(fā)育信號(hào)的傳遞。該基因的缺失導(dǎo)致病原菌對(duì)果膠和半乳糖的利用能力受到嚴(yán)重影響，且可以引起番茄寄主的致病力下降達(dá)到87%，在寄主植物維管束內(nèi)不能成功定殖[12]。幾丁質(zhì)酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應(yīng)和防御反應(yīng)以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[13]。

細(xì)胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒(méi)有同源關(guān)系的基因編碼的多肽，除了包含一些關(guān)鍵基因，也包含一些功能重復(fù)的基因，多個(gè)基因之間相互調(diào)控，共同參與了真菌生物學(xué)毒性的產(chǎn)生過(guò)程，因此在缺失功能上冗余的其中一個(gè)基因后并不會(huì)產(chǎn)生致病力的變化，但一些關(guān)鍵基因

的缺失還是會(huì)導(dǎo)致毒力的顯著下降或喪失。總體而言，細(xì)胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細(xì)胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關(guān)的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核能夠在土壤中存活數(shù)10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環(huán)境。微菌核是自然界最初的侵染源，當(dāng)外界自然環(huán)境適宜時(shí)植物的根系分泌物會(huì)誘導(dǎo)微菌核萌發(fā)形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內(nèi)。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關(guān)。

絲狀真菌會(huì)分泌包含8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)域（約100個(gè)氨基酸）的小分子量蛋白質(zhì)，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結(jié)構(gòu)的形成和有性生殖等很多方面都發(fā)揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產(chǎn)微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環(huán)境的能力降低，但致病性并沒(méi)有明顯變化。相對(duì)于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達(dá)量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長(zhǎng)期存活有關(guān)。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關(guān)的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產(chǎn)生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)下調(diào)，但疏水蛋白基因VDH1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產(chǎn)生受到顯著抑制，產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，其突變體也能夠形成微菌核，說(shuō)明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測(cè)VdGARP1在微菌核的初始形成階段發(fā)揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個(gè)促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉(zhuǎn)錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調(diào)節(jié)一些黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)大麗輪枝菌對(duì)紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會(huì)影響乙烯合成、黑色素形成和致病性等相關(guān)基因的表達(dá)，其突變株可以產(chǎn)生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關(guān)基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢能力下降，微菌核的產(chǎn)生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個(gè)多功能基因，參與了菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學(xué)功能[20]。

整個(gè)侵染過(guò)程涉及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會(huì)形成附著枝和侵染釘。其中，2個(gè)基因VdNoxB和VdPls1被證實(shí)在侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程發(fā)揮重要作用，VdNoxB編碼一個(gè)膜結(jié)合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個(gè)四跨

膜蛋白，它們形成復(fù)合物，共同定位于附著枝基部。復(fù)合物VdNoxB/VdPls1通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子Crz1介導(dǎo)的信號(hào)途徑，最終促進(jìn)侵染釘?shù)男纬蒣3]。當(dāng)2個(gè)基因分別缺失時(shí)，侵染釘便不能形成，導(dǎo)致菌株的致病力下降。侵染釘衍生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開(kāi)，形成一個(gè)病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效應(yīng)蛋白）以及一些信號(hào)分子通過(guò)囊泡運(yùn)輸和胞吐作用被輸送到這個(gè)侵染界面，形成蛋白環(huán)。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過(guò)程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵染界面的傳輸，導(dǎo)致菌株毒力的下降。在菌株對(duì)根部的感染過(guò)程中，菌絲頸是一個(gè)重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過(guò)抑制和逃避寄主植物的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主的成功感染[4]。

1.2 細(xì)胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會(huì)分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細(xì)胞壁降解酶（CWDE），細(xì)胞壁降解酶通過(guò)降解寄主的細(xì)胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準(zhǔn)備。CWDE可分為果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數(shù)量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時(shí)間內(nèi)掃除植物體內(nèi)一些果膠物質(zhì)的障礙，進(jìn)而完成在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的定殖和擴(kuò)散，同時(shí)不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細(xì)胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產(chǎn)生的果膠，其降解產(chǎn)物還可以作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[6]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個(gè)PL1家族的果膠裂解酶和10個(gè)GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時(shí)，不同果膠酶對(duì)病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對(duì)致病力并沒(méi)有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質(zhì)酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物的防御反應(yīng)，2個(gè)基因的缺失均能夠?qū)е戮闢d991在棉花寄主上的毒力顯著降低。內(nèi)切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEg-1對(duì)于早期的侵染定殖至關(guān)重要，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是一種重要的細(xì)胞壁降解酶，研究證實(shí)VdSSP1的缺失能夠降低其對(duì)果膠和淀粉的利用率以及對(duì)棉花的致病力[11]。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶VdSNF1（sucro non-fermenting protein kina 1，SNF1）是細(xì)胞壁水解酶上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，主要參與糖類信號(hào)和真菌發(fā)育信號(hào)的傳遞。該基因的缺失導(dǎo)致病原菌對(duì)果膠和半乳糖的利用能力受到嚴(yán)重影響，且可以引起番茄寄主的致病力下降達(dá)到87%，在寄主植物維管束內(nèi)不能成功定殖[12]。幾丁質(zhì)酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應(yīng)和防御反應(yīng)以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[13]。

細(xì)胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒(méi)有同源關(guān)系的基因編碼的多肽，除了包含一些關(guān)鍵基因，也包含一些功能重復(fù)的基因，多個(gè)基因之間相互調(diào)控，共同參與了真菌生物學(xué)毒性的產(chǎn)生過(guò)程，因此在缺失功能上冗余的其中一個(gè)基因后并不會(huì)產(chǎn)生致病力的變化，但一些關(guān)鍵基因的缺失還是會(huì)導(dǎo)致毒力的顯著下降或喪失。總體而言，細(xì)胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細(xì)胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關(guān)的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核能夠在土壤中存活數(shù)10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環(huán)境。微菌核是自然界最初的侵染源，當(dāng)外界自然環(huán)境適宜時(shí)植物的根系分泌物會(huì)誘導(dǎo)微菌核萌發(fā)形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內(nèi)。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關(guān)。

絲狀真菌會(huì)分泌包含8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)域（約100個(gè)氨基酸）的小分子量蛋白質(zhì)，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結(jié)構(gòu)的形成和有性生殖等很多方面都發(fā)揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產(chǎn)微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環(huán)境的能力降低，但致病性并沒(méi)有明顯變化。相對(duì)于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達(dá)量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長(zhǎng)期存活有關(guān)。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關(guān)的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產(chǎn)生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)下調(diào)，但疏水蛋白基因VDH1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產(chǎn)生受到顯著抑制，產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，其突變體也能夠形成微菌核，說(shuō)明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測(cè)VdGARP1在微菌核的初始形成階段發(fā)揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個(gè)促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉(zhuǎn)錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調(diào)節(jié)一些黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)大麗輪枝菌對(duì)紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會(huì)影響乙烯合成、黑色素形成和致病性等相關(guān)基因的表達(dá)，其突變株可以產(chǎn)生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關(guān)基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢能力下降，微菌核的產(chǎn)生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個(gè)多功能基因，參與了菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學(xué)功能[20]。

整個(gè)侵染過(guò)程涉及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會(huì)形成附著枝和侵染釘。其中，2個(gè)基因VdNoxB和VdPls1被證實(shí)在侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程發(fā)揮重要作用，VdNoxB編碼一個(gè)膜結(jié)合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個(gè)四跨膜蛋白，它們形成復(fù)合物，共同定位于附著枝基部。復(fù)合物VdNoxB/VdPls1通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子Crz1介導(dǎo)的信號(hào)途徑，最終促進(jìn)侵染釘?shù)男纬蒣3]。當(dāng)2個(gè)基因分別缺失時(shí)，侵染釘便不能形成，導(dǎo)致菌株的致病力下降。侵染釘衍生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開(kāi)，形成一個(gè)病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效應(yīng)蛋白）以及一些信號(hào)分子通過(guò)囊泡運(yùn)輸和胞吐作用被輸送到這個(gè)侵染界面，形成蛋白環(huán)。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過(guò)程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵染界面的傳輸，導(dǎo)致菌株毒力的下降。在菌株對(duì)根部的感染過(guò)程中，菌絲頸是一個(gè)重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過(guò)抑制和逃避寄主植物的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主的成功感染[4]。

1.2 細(xì)胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會(huì)分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細(xì)胞壁降解酶（CWDE），細(xì)胞壁降解酶通過(guò)降解寄主的細(xì)胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準(zhǔn)備。CWDE可分為果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數(shù)量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時(shí)間內(nèi)掃除植物體內(nèi)一些果膠物質(zhì)的障礙，進(jìn)而完成在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的定殖和擴(kuò)散，同時(shí)不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細(xì)胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產(chǎn)生的果膠，其降解產(chǎn)物還可以作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[6]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個(gè)PL1家族的果膠裂解酶和10個(gè)GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時(shí)，不同果膠酶對(duì)病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對(duì)致病力并沒(méi)有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質(zhì)酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物的防御反應(yīng)，2個(gè)基因的缺失均能夠?qū)е戮闢d991在棉花寄主上的毒力顯著降低。內(nèi)切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEg-1對(duì)于早期的侵染定殖至關(guān)重要，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是一種重要的細(xì)胞壁降解酶，研究證實(shí)VdSSP1的缺失能夠降低其對(duì)果膠和淀粉的利用率以及對(duì)棉花的致病力[11]。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶VdSNF1（sucro non-fermenting protein kina 1，SNF1）是細(xì)胞壁水解酶上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，主要參與糖類信號(hào)和真菌發(fā)育信號(hào)的傳遞。該基因的缺失導(dǎo)致病原菌對(duì)果膠和半乳糖的利用能力受到嚴(yán)重影響，且可以引起番茄寄主的致

病力下降達(dá)到87%，在寄主植物維管束內(nèi)不能成功定殖[12]。幾丁質(zhì)酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應(yīng)和防御反應(yīng)以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[13]。

細(xì)胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒(méi)有同源關(guān)系的基因編碼的多肽，除了包含一些關(guān)鍵基因，也包含一些功能重復(fù)的基因，多個(gè)基因之間相互調(diào)控，共同參與了真菌生物學(xué)毒性的產(chǎn)生過(guò)程，因此在缺失功能上冗余的其中一個(gè)基因后并不會(huì)產(chǎn)生致病力的變化，但一些關(guān)鍵基因的缺失還是會(huì)導(dǎo)致毒力的顯著下降或喪失。總體而言，細(xì)胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細(xì)胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關(guān)的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核能夠在土壤中存活數(shù)10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環(huán)境。微菌核是自然界最初的侵染源，當(dāng)外界自然環(huán)境適宜時(shí)植物的根系分泌物會(huì)誘導(dǎo)微菌核萌發(fā)形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內(nèi)。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關(guān)。

絲狀真菌會(huì)分泌包含8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)域（約100個(gè)氨基酸）的小分子量蛋白質(zhì)，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結(jié)構(gòu)的形成和有性生殖等很多方面都發(fā)揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產(chǎn)微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環(huán)境的能力降低，但致病性并沒(méi)有明顯變化。相對(duì)于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達(dá)量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長(zhǎng)期存活有關(guān)。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關(guān)的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產(chǎn)生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)下調(diào)，但疏水蛋白基因VDH1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產(chǎn)生受到顯著抑制，產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，其突變體也能夠形成微菌核，說(shuō)明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測(cè)VdGARP1在微菌核的初始形成階段發(fā)揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個(gè)促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉(zhuǎn)錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調(diào)節(jié)一些黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)大麗輪枝菌對(duì)紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會(huì)影響乙烯合成、黑色素形成和致病性等相關(guān)基因的表達(dá)，其突變株可以產(chǎn)生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關(guān)基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢能力下降，微

菌核的產(chǎn)生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個(gè)多功能基因，參與了菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學(xué)功能[20]。

整個(gè)侵染過(guò)程涉及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會(huì)形成附著枝和侵染釘。其中，2個(gè)基因VdNoxB和VdPls1被證實(shí)在侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程發(fā)揮重要作用，VdNoxB編碼一個(gè)膜結(jié)合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個(gè)四跨膜蛋白，它們形成復(fù)合物，共同定位于附著枝基部。復(fù)合物VdNoxB/VdPls1通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子Crz1介導(dǎo)的信號(hào)途徑，最終促進(jìn)侵染釘?shù)男纬蒣3]。當(dāng)2個(gè)基因分別缺失時(shí)，侵染釘便不能形成，導(dǎo)致菌株的致病力下降。侵染釘衍生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開(kāi)，形成一個(gè)病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效應(yīng)蛋白）以及一些信號(hào)分子通過(guò)囊泡運(yùn)輸和胞吐作用被輸送到這個(gè)侵染界面，形成蛋白環(huán)。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過(guò)程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵染界面的傳輸，導(dǎo)致菌株毒力的下降。在菌株對(duì)根部的感染過(guò)程中，菌絲頸是一個(gè)重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過(guò)抑制和逃避寄主植物的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主的成功感染[4]。

1.2 細(xì)胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會(huì)分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細(xì)胞壁降解酶（CWDE），細(xì)胞壁降解酶通過(guò)降解寄主的細(xì)胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準(zhǔn)備。CWDE可分為果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數(shù)量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時(shí)間內(nèi)掃除植物體內(nèi)一些果膠物質(zhì)的障礙，進(jìn)而完成在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的定殖和擴(kuò)散，同時(shí)不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細(xì)胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產(chǎn)生的果膠，其降解產(chǎn)物還可以作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[6]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個(gè)PL1家族的果膠裂解酶和10個(gè)GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時(shí)，不同果膠酶對(duì)病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對(duì)致病力并沒(méi)有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質(zhì)酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物的防御反應(yīng)，2個(gè)基因的缺失均能夠?qū)е戮闢d991在棉花寄主上的毒力顯著降低。內(nèi)切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEg-1對(duì)于早期的侵染定殖至關(guān)重要，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是一種重要的細(xì)胞壁降解酶，研究證實(shí)VdSSP1的缺失能夠降低其對(duì)果膠和淀粉的利用率以及對(duì)棉花的致病力[11]。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶VdSNF1（sucro non-fermenting protein kina 1，

SNF1）是細(xì)胞壁水解酶上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，主要參與糖類信號(hào)和真菌發(fā)育信號(hào)的傳遞。該基因的缺失導(dǎo)致病原菌對(duì)果膠和半乳糖的利用能力受到嚴(yán)重影響，且可以引起番茄寄主的致病力下降達(dá)到87%，在寄主植物維管束內(nèi)不能成功定殖[12]。幾丁質(zhì)酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應(yīng)和防御反應(yīng)以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[13]。

細(xì)胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒(méi)有同源關(guān)系的基因編碼的多肽，除了包含一些關(guān)鍵基因，也包含一些功能重復(fù)的基因，多個(gè)基因之間相互調(diào)控，共同參與了真菌生物學(xué)毒性的產(chǎn)生過(guò)程，因此在缺失功能上冗余的其中一個(gè)基因后并不會(huì)產(chǎn)生致病力的變化，但一些關(guān)鍵基因的缺失還是會(huì)導(dǎo)致毒力的顯著下降或喪失。總體而言，細(xì)胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細(xì)胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關(guān)的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核能夠在土壤中存活數(shù)10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環(huán)境。微菌核是自然界最初的侵染源，當(dāng)外界自然環(huán)境適宜時(shí)植物的根系分泌物會(huì)誘導(dǎo)微菌核萌發(fā)形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內(nèi)。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關(guān)。

絲狀真菌會(huì)分泌包含8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)域（約100個(gè)氨基酸）的小分子量蛋白質(zhì)，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結(jié)構(gòu)的形成和有性生殖等很多方面都發(fā)揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產(chǎn)微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環(huán)境的能力降低，但致病性并沒(méi)有明顯變化。相對(duì)于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達(dá)量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長(zhǎng)期存活有關(guān)。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關(guān)的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產(chǎn)生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)下調(diào)，但疏水蛋白基因VDH1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產(chǎn)生受到顯著抑制，產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，其突變體也能夠形成微菌核，說(shuō)明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測(cè)VdGARP1在微菌核的初始形成階段發(fā)揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個(gè)促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉(zhuǎn)錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調(diào)節(jié)一些黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)大麗輪枝菌對(duì)紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會(huì)影響乙烯合

成、黑色素形成和致病性等相關(guān)基因的表達(dá)，其突變株可以產(chǎn)生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關(guān)基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢能力下降，微菌核的產(chǎn)生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個(gè)多功能基因，參與了菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學(xué)功能[20]。

整個(gè)侵染過(guò)程涉及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會(huì)形成附著枝和侵染釘。其中，2個(gè)基因VdNoxB和VdPls1被證實(shí)在侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程發(fā)揮重要作用，VdNoxB編碼一個(gè)膜結(jié)合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個(gè)四跨膜蛋白，它們形成復(fù)合物，共同定位于附著枝基部。復(fù)合物VdNoxB/VdPls1通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子Crz1介導(dǎo)的信號(hào)途徑，最終促進(jìn)侵染釘?shù)男纬蒣3]。當(dāng)2個(gè)基因分別缺失時(shí)，侵染釘便不能形成，導(dǎo)致菌株的致病力下降。侵染釘衍生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開(kāi)，形成一個(gè)病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效應(yīng)蛋白）以及一些信號(hào)分子通過(guò)囊泡運(yùn)輸和胞吐作用被輸送到這個(gè)侵染界面，形成蛋白環(huán)。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過(guò)程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵染界面的傳輸，導(dǎo)致菌株毒力的下降。在菌株對(duì)根部的感染過(guò)程中，菌絲頸是一個(gè)重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過(guò)抑制和逃避寄主植物的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主的成功感染[4]。

1.2 細(xì)胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會(huì)分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細(xì)胞壁降解酶（CWDE），細(xì)胞壁降解酶通過(guò)降解寄主的細(xì)胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準(zhǔn)備。CWDE可分為果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數(shù)量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時(shí)間內(nèi)掃除植物體內(nèi)一些果膠物質(zhì)的障礙，進(jìn)而完成在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的定殖和擴(kuò)散，同時(shí)不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細(xì)胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產(chǎn)生的果膠，其降解產(chǎn)物還可以作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[6]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個(gè)PL1家族的果膠裂解酶和10個(gè)GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時(shí)，不同果膠酶對(duì)病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對(duì)致病力并沒(méi)有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質(zhì)酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物的防御反應(yīng)，2個(gè)基因的缺失均能夠?qū)е戮闢d991在棉花寄主上的毒力顯著降低。內(nèi)切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEg-1對(duì)于早期的侵染定殖至關(guān)重要，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是

一種重要的細(xì)胞壁降解酶，研究證實(shí)VdSSP1的缺失能夠降低其對(duì)果膠和淀粉的利用率以及對(duì)棉花的致病力[11]。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶VdSNF1（sucro non-fermenting protein kina 1，SNF1）是細(xì)胞壁水解酶上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，主要參與糖類信號(hào)和真菌發(fā)育信號(hào)的傳遞。該基因的缺失導(dǎo)致病原菌對(duì)果膠和半乳糖的利用能力受到嚴(yán)重影響，且可以引起番茄寄主的致病力下降達(dá)到87%，在寄主植物維管束內(nèi)不能成功定殖[12]。幾丁質(zhì)酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應(yīng)和防御反應(yīng)以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[13]。

細(xì)胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒(méi)有同源關(guān)系的基因編碼的多肽，除了包含一些關(guān)鍵基因，也包含一些功能重復(fù)的基因，多個(gè)基因之間相互調(diào)控，共同參與了真菌生物學(xué)毒性的產(chǎn)生過(guò)程，因此在缺失功能上冗余的其中一個(gè)基因后并不會(huì)產(chǎn)生致病力的變化，但一些關(guān)鍵基因的缺失還是會(huì)導(dǎo)致毒力的顯著下降或喪失。總體而言，細(xì)胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細(xì)胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關(guān)的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核能夠在土壤中存活數(shù)10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環(huán)境。微菌核是自然界最初的侵染源，當(dāng)外界自然環(huán)境適宜時(shí)植物的根系分泌物會(huì)誘導(dǎo)微菌核萌發(fā)形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內(nèi)。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關(guān)。

絲狀真菌會(huì)分泌包含8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)域（約100個(gè)氨基酸）的小分子量蛋白質(zhì)，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結(jié)構(gòu)的形成和有性生殖等很多方面都發(fā)揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產(chǎn)微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環(huán)境的能力降低，但致病性并沒(méi)有明顯變化。相對(duì)于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達(dá)量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長(zhǎng)期存活有關(guān)。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關(guān)的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產(chǎn)生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)下調(diào)，但疏水蛋白基因VDH1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產(chǎn)生受到顯著抑制，產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，其突變體也能夠形成微菌核，說(shuō)明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測(cè)VdGARP1在微菌核的初始形成階段發(fā)揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個(gè)促分裂原蛋白激酶（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉(zhuǎn)錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調(diào)節(jié)一些黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以

增強(qiáng)大麗輪枝菌對(duì)紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會(huì)影響乙烯合成、黑色素形成和致病性等相關(guān)基因的表達(dá)，其突變株可以產(chǎn)生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關(guān)基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢能力下降，微菌核的產(chǎn)生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個(gè)多功能基因，參與了菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學(xué)功能[20]。

整個(gè)侵染過(guò)程涉及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。在侵染的初始階段，與稻瘟病菌一樣，大麗輪枝菌也會(huì)形成附著枝和侵染釘。其中，2個(gè)基因VdNoxB和VdPls1被證實(shí)在侵染釘?shù)男纬蛇^(guò)程發(fā)揮重要作用，VdNoxB編碼一個(gè)膜結(jié)合型NADPH氧化酶的催化亞基，VdPls1編碼一個(gè)四跨膜蛋白，它們形成復(fù)合物，共同定位于附著枝基部。復(fù)合物VdNoxB/VdPls1通過(guò)介導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生來(lái)提高細(xì)胞內(nèi)的鈣離子含量，進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子Crz1介導(dǎo)的信號(hào)途徑，最終促進(jìn)侵染釘?shù)男纬蒣3]。當(dāng)2個(gè)基因分別缺失時(shí)，侵染釘便不能形成，導(dǎo)致菌株的致病力下降。侵染釘衍生形成的菌絲頸將附著枝和侵染菌絲分離開(kāi)，形成一個(gè)病原菌-寄主侵染界面，分泌的蛋白（如毒力蛋白、效應(yīng)蛋白）以及一些信號(hào)分子通過(guò)囊泡運(yùn)輸和胞吐作用被輸送到這個(gè)侵染界面，形成蛋白環(huán)。大麗輪枝菌的VdSep5基因、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)因子VdSec22和VdSyn8以及胞外亞基VdExo70參與分泌蛋白向侵染界面的傳送過(guò)程，這些基因的缺失均能夠阻礙分泌蛋白向侵染界面的傳輸，導(dǎo)致菌株毒力的下降。在菌株對(duì)根部的感染過(guò)程中，菌絲頸是一個(gè)重要的蛋白分泌部位，分泌的蛋白通過(guò)抑制和逃避寄主植物的防御反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)寄主的成功感染[4]。

1.2 細(xì)胞壁降解酶基因

真菌侵入宿主植物后會(huì)分泌出一些胞外活性蛋白酶，比如細(xì)胞壁降解酶（CWDE），細(xì)胞壁降解酶通過(guò)降解寄主的細(xì)胞壁突破寄主表面的物理屏障，為侵染做準(zhǔn)備。CWDE可分為果膠酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、木聚糖酶、內(nèi)葡聚糖酶、蛋白酶等，與其他真菌相比，大麗輪枝菌編碼更多數(shù)量和種類的碳水化合物降解酶基因[5]，這能夠解釋大麗輪枝菌在接種后能夠在較短時(shí)間內(nèi)掃除植物體內(nèi)一些果膠物質(zhì)的障礙，進(jìn)而完成在木質(zhì)部導(dǎo)管內(nèi)的定殖和擴(kuò)散，同時(shí)不同的水解酶能夠降解不同寄主植物的細(xì)胞壁組織，也是大麗輪枝菌具有廣泛寄主的原因之一。大麗輪枝菌編碼最多的水解酶類是多糖裂解酶，可以水解不同種類的果膠，這些多糖裂解酶包括PL1家族、PL3家族和PL9家族中的果膠酶以及PL4家族和PL11家族的鼠李糖苷裂解酶等。大麗輪枝菌中含有豐富的果膠酶，果膠酶可以水解寄主植物所產(chǎn)生的果膠，其降解產(chǎn)物還可以作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為病原菌的生長(zhǎng)發(fā)育提供能量[6]。利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到大麗輪枝菌分泌組中存在大量的果膠酶[7]，包括14個(gè)PL1家族的果膠裂解酶和10個(gè)GH28家族的果膠水解酶，大麗輪枝菌分泌的果膠酶與其致病力相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株分泌的果膠酶較多，而弱致病力菌株分泌的果膠酶則較少甚至不分泌。同時(shí)，不同果膠酶對(duì)病原菌致病力的影響存在較大差異，有些果膠酶基因的缺失能夠引起菌株致病力的下降，而有些果膠酶基因的缺失對(duì)致病力并沒(méi)有影響。果膠酶基因VdPEL1[8]和角質(zhì)酶基因VdCUT11[9]都能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和植物的防御反應(yīng)，2個(gè)基因的缺失均能夠?qū)е戮闢d991在棉花寄主上的毒力顯著

降低。內(nèi)切葡聚糖酶能夠降解植物的纖維素，內(nèi)切葡聚糖酶基因VdEg-1對(duì)于早期的侵染定殖至關(guān)重要，該基因的缺失導(dǎo)致病原菌在萵苣上不能很好地定殖[10]。特異分泌蛋白VdSSP1是一種重要的細(xì)胞壁降解酶，研究證實(shí)VdSSP1的缺失能夠降低其對(duì)果膠和淀粉的利用率以及對(duì)棉花的致病力[11]。蔗糖非發(fā)酵蛋白激酶VdSNF1（sucro non-fermenting protein kina 1，SNF1）是細(xì)胞壁水解酶上游的一個(gè)負(fù)調(diào)控基因，主要參與糖類信號(hào)和真菌發(fā)育信號(hào)的傳遞。該基因的缺失導(dǎo)致病原菌對(duì)果膠和半乳糖的利用能力受到嚴(yán)重影響，且可以引起番茄寄主的致病力下降達(dá)到87%，在寄主植物維管束內(nèi)不能成功定殖[12]。幾丁質(zhì)酶基因（VdECH）編碼的蛋白能夠引起植物的超敏反應(yīng)和防御反應(yīng)以及一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)[13]。

細(xì)胞壁降解酶大部分是多基因家族或沒(méi)有同源關(guān)系的基因編碼的多肽，除了包含一些關(guān)鍵基因，也包含一些功能重復(fù)的基因，多個(gè)基因之間相互調(diào)控，共同參與了真菌生物學(xué)毒性的產(chǎn)生過(guò)程，因此在缺失功能上冗余的其中一個(gè)基因后并不會(huì)產(chǎn)生致病力的變化，但一些關(guān)鍵基因的缺失還是會(huì)導(dǎo)致毒力的顯著下降或喪失。總體而言，細(xì)胞壁降解酶的種類非常豐富，且一些細(xì)胞壁降解酶在大麗輪枝菌致病過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。

1.3 微菌核和黑色素形成相關(guān)的致病基因

大麗輪枝菌具有微菌核的休眠結(jié)構(gòu)，微菌核能夠在土壤中存活數(shù)10年甚至20年以上。微菌核多呈橢圓形，具有瘤狀凸起，由單根或數(shù)根菌絲經(jīng)分隔膨大、孢壁增厚，膨大的菌絲芽殖成堆形成微菌核，微菌核中黑色素的形成有利于其抵抗不良環(huán)境。微菌核是自然界最初的侵染源，當(dāng)外界自然環(huán)境適宜時(shí)植物的根系分泌物會(huì)誘導(dǎo)微菌核萌發(fā)形成菌絲，菌絲附著在寄主植物的根部，并可以從根部表皮破裂處侵入植物體內(nèi)。大量研究表明，大麗輪枝菌微菌核的形成與致病力呈正相關(guān)。

絲狀真菌會(huì)分泌包含8個(gè)半胱氨酸殘基保守結(jié)構(gòu)域（約100個(gè)氨基酸）的小分子量蛋白質(zhì)，由于其疏水性能被稱為疏水蛋白。疏水蛋白在真菌于植物表面的附著、侵染結(jié)構(gòu)的形成和有性生殖等很多方面都發(fā)揮著重要功能。VDH1是大麗輪枝菌的疏水蛋白同源基因，VDH1基因的敲除突變株產(chǎn)微菌核的能力顯著下降，分生孢子耐干燥環(huán)境的能力降低，但致病性并沒(méi)有明顯變化。相對(duì)于菌絲融合階段和分生孢子形成階段，VDH1在微菌核形成階段的表達(dá)量更高[14]。這表明VDH1基因參與微菌核的形成，與大麗輪枝菌的長(zhǎng)期存活有關(guān)。

煙曲霉中Aayg1基因是與黑色素合成相關(guān)的基因，大麗輪枝菌中的同源基因Vayg1的缺失突變體中黑色素的產(chǎn)生和微菌核的形成均受到抑制[15]，致病力下降。缺失突變體中與黑色素生物合成相關(guān)的一些基因的表達(dá)下調(diào)，但疏水蛋白基因VDH1的表達(dá)并沒(méi)有發(fā)生改變。

谷氨酸富集蛋白的編碼基因（VdGARP1）突變體微菌核的產(chǎn)生受到顯著抑制，產(chǎn)孢能力和生長(zhǎng)速度降低，致病力下降。但在極其貧瘠的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下，其突變體也能夠形成微菌核，說(shuō)明VdGARP1不是微菌核形成所必需的，推測(cè)VdGARP1在微菌核的初始形成階段發(fā)揮重要的作用[16]。Rauyaree等[17]從大麗輪枝菌中克隆到VMK1，該基因編碼一個(gè)促分裂原蛋白激酶

（MAPK），研究表明該基因影響微菌核的形成。轉(zhuǎn)錄因子VdCmr1 和聚酮合酶基因VdPKS1均參與大麗輪枝菌的黑色素合成途徑，VdCmr1可以調(diào)節(jié)一些黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)，以增強(qiáng)大麗輪枝菌對(duì)紫外線或高溫等一些非生物威脅的耐受性[18]，聚酮合酶基因PKS1在很多真菌中參與二羥基萘黑色素合成途徑，大麗輪枝菌的同源基因VdPKS1的缺失會(huì)影響乙烯合成、黑色素形成和致病性等相關(guān)基因的表達(dá)，其突變株可以產(chǎn)生微菌核但黑色素形成受阻，菌株的致病力降低[19]。致病力相關(guān)基因VdPR3的缺失突變體菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢能力下降，微菌核的產(chǎn)生受到抑制，纖維素酶和淀粉酶的活性降低，VdPR3是一個(gè)多功能基因，參與了菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育、菌株的致病性和胞外酶活性等多方面的生物學(xué)功能[20]。