_慈竹C3H基因克隆及其生物信息學分析

2024年2月8日發(作者：鐘離春)

32（1）：38～46植物研究2012，BulletinofBotanicalRearch慈竹C3H基因克隆及其生物信息學分析周美娟胡尚連*曹穎盧學琴任鵬吳曉宇李曉瑞（西南科技大學生命科學與工程學院，綿陽621010）摘要3-PCR技術克隆香豆酸-羥化酶（C3H）是調控植物木質素生物合成的關鍵酶，本文以慈竹為材料，利用RT-慈竹C3H基因，并對其進行生物信息學分析，為通過基因工程手段降低工業用竹木質素含量奠定基礎。結果表明，該cDNA序列全長為1581bp，編碼區為1539bp，編碼512個氨基酸，蛋白分子量為58．33KD，等電點為9.09；氨基酸序即P450結構域。系統進化分析表明，該基因與毛竹和水稻的C3H基因具有列和結構分析顯示C3H有一個保守區域，很高的同源性。慈竹與毛竹和水稻C3H基因編碼蛋白為親水性蛋白，這三種編碼蛋白很可能定位在內質網（膜）上，其編碼蛋白的二級結構及三級結構都含有豐富的α-螺旋和無規卷曲，β-轉角和延伸鏈的含量較少，都含有2個相對保守的無序化區域。該基因已在GenBank上注冊，基因序列登錄號為JF693629，可能與慈竹木質素的生物合成有關。關鍵詞慈竹；C3H基因；克隆；生物信息學分析文獻標識碼：A文章編號：1673－5102（2012）01－0038－09中圖分類號：S718．46CloningandBioinformationAnalysisofC3HGeneinNeosinocalamusaffinisZHOUMei-JuanHUShang-Lian*CAOYingLUXue-QinRENPengWUXiao-YuLIXiao-Rui（CollegeofLifeScienceandEngineering，SouthwestUniversityofScienceandTechnology，Mianyang621010）Abstractp-Coumarate3-hydroxylaplaysanimportantroleinthebiosynthesispathwaysofplantlignin．Thefull-lengthquenceofC3HinNeosinocalamusaffinis（NaC3H）wassuccessfullyclonedbyRT-PCR，anditsbioinformationanalysiswascarriedout．Itaimstoprovidetheoreticalbasisfordecreasingthecontentoflignininbambooformaking-pulpthroughengineeringtechnique．Thequenceis1581bpinlength．ThebioinformationanalysisshowedthattheCDSregionofthenucleotidequencewas1539bp，encoding512predictedaminoacids．Theproteinmolecularweightwas58．33kDandtheoreticalpIwas9．09．Accordingtotheaminoacid-quenceandstructuralanalysis，itshowedthattheproteinencodingbyC3Hcontainedoneconrveddomain，viz．P450domain．PhylogeneticanalysisshowedthatNaC3HwasmostsimilartoC3HfromP．edulisandOryzasativa．TheproteinncodedbyC3Hgeneswerehydrophilicones．Subcellularlocalizationsofthethreepro-teinswereintheendoplasmicreticulum（membrane）．Thecondarystructuresandtertiarystructureswerea-bundantinalphahelixsandrandomcoils，betaturnsandextendedstrainswereless．Tworelativeconrveddis-ordereddomainswerefoundinaminoacidquencencodedbyC3HgenesfromN．affinis，P．edulisandO．sa-tiva．Thefull-lengthquenceofNaC3HhasbeensubmittedtoGenBankwiththeaccessionnumberJF693629．KeywordsNeosinocalamusaffinis；C3Hgene；cloning；bioinformationanalysis木質素是地球上含量豐富的一類有機物質，僅次于纖維素的含量，具有豐富的生物學功能，在抵御植物病害襲擊，抗擊外來侵襲，維持植物正常生［1］長等方面發揮著巨大的作用。但是，在制漿造紙過程中，為脫除木質素必須使用大量化學藥品，不僅加大了造紙成本，更嚴重的是對環境造成了污染。隨著木質素生物合成途徑的不斷完善及其相關基因的克隆，通過基因工程技術調控植物木質素［2］的生物合成，來改進紙漿生產已經成為可能。CYP450）是一類細胞色素P450（cytochrome，“十二五”101）；四川主要叢生竹定向培育技術項目基金項目：四川省重點攻關資助項目；四川省應用基礎研究基金資助項目（05JY029-資助（10zx1102）第一作者簡介：周美娟（1985—），女，碩士研究生，從事植物遺傳與品種改良研究。*mail：hushanglian@126．com通訊作者：E-收稿日期：2011－06－08

1期周美娟等：慈竹C3H基因克隆及其生物信息學分析39以還原態與CO結合后，在450nm處具有最高吸收峰的含血紅素的單鏈蛋白質。在所有已知結構的P450中都存在一個保守的血紅素結合域，含有x-x-Gly-x-Arg-x-Cys-x-Gly序列，是鑒定保守的Phe-P450的主要序列依據，其中半胱氨酸（Cys）是亞鐵在所有的P450中完全保血紅素的第5個軸配體，守。植物細胞色素P450對植物生長發育具有重要的生物學功能，參與木質素中間物、赤霉素、生油菜素類固醇激素等代謝物的生物合成。物堿、3-coumarate3-hydroxyla，香豆酸-羥化酶（p-C3H）屬于細胞色素P450中的CYP98亞家族，是木質素生物合成途徑中催化苯丙烷反應的關鍵酶決定木質素單體的碳源流向，也是苯丙烷途之一，。Schoch等［5］用功能基因組的方法首次證明從擬南芥中分離得到的CYP98A3是C3H徑的限速酶基因，證實C3H屬于P450蛋白，對香豆酰奎寧酸和香豆酰莽草酸表現出很高的催化活性，在木質部［6］表達。隨后Franke等對突變體ref8的研究也證［5］專家學者已經從擬南芥、毛實了這一點。目前，［7］［8］［9］［10］竹、銀杏、芝麻、小麥等植物中克隆出了C3H基因，而有關慈竹C3H基因克隆的研究尚未［4］［3］［3］限制性內切酶，均購自MBI（Fermentas）公司；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存。1．31．3．1方法總RNA的提取與cDNA鏈的合成參照植物總RNA提取試劑盒的說明書方法提電泳后經凝膠成像系統進行觀察并拍取總RNA，照。選擇MBI公司的RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit反轉錄試劑盒，以oligo（dT）18為引物，MuLV反轉錄酶進行cDNA合成。用RevertAidTMM-1．3．2用RT-PCR的方法獲得C3H基因的編碼區序列根據已登錄在GenBank上的毛竹的C3H基因的核苷酸序列，使用PrimerPremier5．0軟件設計克隆慈竹C3H基因的全長引物，引物序列為：上游AACCCAAAGCAAGCCACCATG-引物（P1）：5'-3'；下游引物（P2）：5'-CCAAGCAGCACAGAGTGCTCA-3'。以反轉錄生成的cDNA為模板，采用LA-TaqDNA聚合酶進行全長序列擴增。PCR反應條件為：95℃變性30s；58℃退火30s；72℃延伸2min；30個循環；72℃延伸10min；4℃保持。PCR擴增產物與pMD19-TVector（大連TaKa-Ra公司）連接，測序。1．3．3慈竹C3H基因全長序列的生物信息學分析（1）C3H基因系統發生樹的構建利用Mega4軟件，對慈竹的C3H基因和NCBI數據庫中搜索得到的其他物種的C3H基因全長序Joining列進行系統進化樹的構建。采取Neighbor-法構建系統進化樹，對生成的系統進化樹進行Bootstrap校正，生成最終的系統進化樹。（2）C3H基因編碼蛋白的理化性質分析利用NCBI（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov）中finder軟件找出慈竹C3H基因的開放讀碼的ORF-框，然后利用ExPaSy工具（http：//au．expasy．org/tools/）中提供的Prot-Param軟件和ProtScale軟件分別進行氨基酸殘基數目、組成、蛋白質相對分子質量、理論等電點和親/疏水性的在線分析。（3）C3H基因編碼蛋白的二級結構分析利用ExPaSy工具中的SOPMA軟件在線預測helix，H）、turn，T）、分析α-螺旋（α-β-轉角（β-無規C）以及延伸鏈（extended則卷曲（randomcoil，strand，E）等，然后利用網站ExPaSy工具中的PSORT軟件預測蛋白亞細胞定位。（4）C3H基因編碼蛋白的三級結構分析主三級結構的預測是蛋白質結構預測的重點，見報道。慈竹（Neosinocalamusaffinis）是我國西南地區栽培最普遍的經濟竹種之一，具有生長快、易繁殖的特點，是優良的造紙材料。本研究室利用RACE技術已克隆到慈竹的4CL（4-香豆酸輔酶Acoumarate：CoAliga，連接酶；4-簡稱為4CL）全長cDNA序列（Genbank：EU327341）［11］，并已建立梁山［12］慈竹愈傷組織培養與植株再生體系。因此，本研究以慈竹為材料，對其C3H基因進行克隆，并進行生物信息學方面的分析，以期為慈竹C3H基因在大型叢生工業用竹遺傳改良中的應用提供理論依據。11．1材料與方法材料以產自四川省眉山市青神縣慈竹的嫩莖為材料，將其放在液氮中保存，帶回實驗室，置于－80℃超低溫冰柜中待用。1．2主要試劑與菌種LA-Taq聚合酶、DL2000DNAMarker、T4連接pMD19-TVector、X-Gal、IPTG，酶、均購自大連TaKaRa公司；植物總RNA提取試劑盒、普通質粒小提取試劑盒均購自TIANGEN公司；膠回收試劑tec公司；RevertAidFirstStrand盒購自OmegaBio-cDNASynthesisKit反轉錄試劑盒、EcoRⅠ、HindⅢ

40植物研究32卷要有以下幾種方法：同源模建、折疊識別和從頭預［13～14］。利用ExPaSy工具中的CPHmodels程測法序進行同源模建，并利用高級結構預測軟件Ras-Mol對C3H基因編碼的蛋白三維結構進行分析。（5）C3H基因編碼蛋白的固有無序化特性分析利用在線程序FoldIndex（http：//bioportalweizmann．ac．il/fldbin/findex）對C3H基因的氨基［15］酸序列進行蛋白質無序特性分析。（GenBank登錄號為JF693629）。利用NCBI的Blastp查找NaC3H基因保守域，經過Pfam14．0程NaC3H序分析，可獲得序列的保守域。結果表明，基因有一個保守區域，其為P450結構域（圖3）。22．1結果與分析慈竹C3H基因全長克隆及其編碼氨基酸序列分析PCR技術克隆得到一條長度約為1利用RT-500多bp的cDNA片段（圖1），經序列測定與分析表明，這條片段為慈竹C3H基因，全長為1581bp（圖2）。通過ORF-finder軟件分析，其ORF框為位于核苷酸序列的22－1560區域，總長為1539bp，編碼512個氨基酸（圖2），該基因命名為NaC3H圖1Fig．1慈竹C3H基因全長擴增結果Amplifiedfull-lengthcDNAfragmentsofC3HgenefromN．affinis圖2Fig．2慈竹C3H基因（NaC3H）全長序列及編碼氨基酸序列Full-lengthquencesandputativeaminoacidofNaC3H（Greyboxescontainresiduesthatareidentical）

1期周美娟等：慈竹C3H基因克隆及其生物信息學分析41圖3Fig．3NaC3H基因編碼蛋白的保守區結構域ConrvedfunctiondomainofaminoacidquencefromNaC3H2．2C3H基因系統發生樹的構建FGAGRRVCPG；慈竹和水稻與毛竹相比，在氨基酸270位置都缺少一個甘氨酸（Gly）。2．4慈竹NaC3H基因與毛竹和水稻C3H基因編碼蛋白的理化性質分析對慈竹、毛竹和水稻進行物理性質分析（表1）可知，慈竹和水稻C3H基因編碼的氨基酸總數一樣，但都比毛竹缺少一個氨基酸（甘氨酸）；慈竹、毛竹和水稻C3H基因編碼的分子量幾乎一致；慈竹NaC3H基因編碼的堿性氨基酸比毛竹的多兩個，比水稻的多3個；而慈竹NaC3H基因編碼的酸但比水稻的多1個；慈性氨基酸比毛竹的少1個，竹NaC3H基因編碼蛋白的理論等電點在三者中為最高，其等電點大于9（表1）。由此可知，編碼的堿性氨基酸的總數比酸性氨基酸的總數多，則該蛋白表現為堿性蛋白，說明慈竹NaC3H基因編碼蛋白與毛竹和水稻C3H基因編碼的蛋白都是堿性蛋白，而且編碼的堿性氨基酸的總數比酸性氨基酸的總數多得越多，其蛋白的等電點就越大。表1性質Table1PhysicalandchemicalpropertiesoftheproteincodedbyC3HgenesfromN．affinis，PhyllostachydulisandOryzasativa編碼的氨基酸Codedaminoacids慈竹N．affinis毛竹P．edulis水稻O．sativa512513512分子量Molecularweight（kD）58．3358．3258．36堿性氨基酸Alkalineaminoacids706867酸性氨基酸理論等電點AcidicaminoTheoreticalacidspI6263619．098．778．96利用Mega4軟件構建了C3H基因系統發生樹（圖4）。利用DNAMAN軟件對其進行多重序列比對，結果表明，慈竹和毛竹的C3H基因的相似性最為96．88%；NaC3H基因與水稻的C3H基因也高，有較高的相似性，為91．21%。從系統發生樹可見，慈竹與毛竹、水稻的C3H基因有很近的進化關系，與高粱和玉米的細胞色素P450家族在進化上也有較近的遺傳距離，而與擬南芥、雜交白楊、咖啡樹和煙草的遺傳距離較遠。因此，從系統發生樹來慈竹NaC3H基因編碼蛋白應屬于CYP98家族看，A亞家族蛋白。慈竹、毛竹和水稻的C3H基因編碼的蛋白序列理化圖4Fig．4plantspecies不同種植物C3H基因的系統進化樹PhylogenetictreeofC3Hgenesfromdifferent根據系統發生樹的結果，以下研究只針對慈竹與毛竹和水稻的C3H基因進行的分析。2．3慈竹NaC3H基因與毛竹和水稻C3H基因編碼的氨基酸序列比對利用EBI在線的ClustalW2對慈竹NaC3H、毛竹和水稻的C3H基因編碼的氨基酸進行序列多重比對（圖5）。根據比對結果發現，這3條氨基酸序具有典型的細胞色素P450的結構列保守性較強，特征，且都含有P450蛋白的氨基酸保守基序2．5慈竹NaC3H基因與毛竹和水稻C3H基因編碼蛋白的疏/親水性分析利用ProtScale軟件的KytandDoolittle算法對慈竹NaC3H基因與毛竹和水稻C3H基因編碼蛋白進行疏水性/親水性預測，正值越大表示越疏水，負值越大表示越親水，介于+0．5到－0．5之間的主要為兩性氨基酸。結果表明，慈竹NaC3H基因

42植物研究32卷與毛竹和水稻C3H基因編碼蛋白大約都是在14248區域具有很強的親區域具有較強的疏水性，水性，其總平均親水性分別為－0．644、－0．644、－0.800，預測這3種蛋白為親水性蛋白，其中，水稻C3H基因編碼蛋白的親水性為最高，慈竹和毛竹的親水性相同。圖5Fig．5慈竹NaC3H基因與毛竹、水稻C3H基因的ClustalW2氨基酸序列多重比對（陰影區為氨基酸保守域；*代表保守氨基AminoacidquencealignmentofNaC3Hwithp-coumarate3-hydroxylasfromP．edulisandO．sativaby（Greyboxescontainresiduesthatareidentical；Asterisksindicatethepositionoftheconrvedaminoacidsinactivesiteregionsof酸位點）ClustalW2plantp-coumarate3-hydroxylas）2．6慈竹NaC3H基因與毛竹和水稻C3H基因編碼蛋白的二級結構分析及亞細胞定位利用SOPMA軟件預測慈竹、毛竹和水稻的C3H基因編碼蛋白二級結構（表2）。慈竹NaC3H基因與毛竹和水稻的C3H基因編碼蛋白的二級結構中含有豐富的α-螺旋和無規卷曲，β-轉角和延伸鏈的含量較少；其中慈竹NaC3H基因編碼蛋白的α-螺旋比毛竹和水稻C3H基因編碼蛋白的α-螺旋多，β-轉角的個數相同，但延伸鏈和無規卷曲個數最少。利用PSORT軟件對慈竹NaC3H基因與毛竹和水稻的C3H基因編碼蛋白進行的亞細胞定位預測（表3），由表3可以得出，這3種植物的C3H基因編碼的蛋白質定位于內質網（膜）、線粒體內膜、細胞膜、內質網（腔內）、葉綠體類囊體膜、胞外的幾率不同，但都以定位于內質網（膜）上的幾率為

1期周美娟等：慈竹C3H基因克隆及其生物信息學分析表343最高，慈竹的為60．0%，毛竹和水稻的都為82.0%，從而推斷，這3種植物的C3H基因編碼的蛋白質定位于內質網（膜）上的可能性最大。表2分析Table2SecondarystructureanalysisofproteinC3HfromN．affinis，P．edulisandO．sativa慈竹N．affinisα-螺旋Alphahelix（Hh）β-轉角Betaturn（Tt）延伸鏈Extendedstrand（Ee）無規卷曲Randomcoil（Cc）263（51．37%）28（5．47%）48（9．38%）173（33．79%）毛竹Phyllostachydulis257（50．10%）28（5．46%）53（10．33%）175（34．11%）水稻Oryzasativa240（46．88%）28（5．47%）54（10．55%）190（37．11%）慈竹、毛竹和水稻的C3H基因編碼蛋白的亞細胞定Subcellularlocalizationpredictionofprotein位分析Table3C3HfromN．affinis，P．edulisandO．sativa慈竹、毛竹和水稻的C3H基因編碼蛋白的二級結構內質網（膜）Endoplasmicreticulum（membrane）葉綠體類囊體膜Chloroplastthylakoidmembrane線粒體內膜Mitochondrialinnermembrane細胞膜Plasmamembrane內質網（腔內）Endoplasmicreticulum（lumen）胞外Outside慈竹N．affinis60．0%37．0%10．0%10．0%毛竹P．edulis82．0%水稻O．sativa82．0%10．0%19．0%10．0%10．0%10．0%51．4%10．0%10．0%圖6Fig．63種植物C3H基因編碼蛋白的三級結構ModeloftertiarystructureofproteincodedbyC3Hgenesfromthreeplantspiecies2．7慈竹NaC3H基因與毛竹和水稻C3H基因編碼蛋白的三級結構預測利用CPHmodels建模服務器對慈竹、毛竹和水稻進行C3H基因編碼蛋白進行三維建模（圖6），以及其保守區結構域的三級結構（圖7）。從圖6可以看到慈竹、毛竹和水稻的C3H基因編碼蛋白三級結構相似，均含有豐富的α-螺旋和無規卷曲，還有少量的β-轉角、延伸鏈，由此可看到其蛋白折疊空間結構構象的變化；從圖7可以看到，這三種植物的C3H基因編碼蛋白共有的保守區結構域三級結構，由10個氨基酸組成：苯丙氨酸（Phe1）、甘氨酸（Gly2）、丙氨酸（Ala3）、甘氨酸（Gly4）、精氨酸（Arg5）、精氨酸（Arg6）、纈氨酸（Val7）、半胱氨酸（Cys8）、脯氨酸（Pro9）、甘氨酸（Gly10）。圖7Fig．7C3H基因編碼蛋白的保守區結構域三級結構ModelofconverddomainoftertiarystructureofproteincodedbyC3Hgene

44植物研究32卷

1期周美娟等：慈竹C3H基因克隆及其生物信息學分析452．8慈竹NaC3H基因與其他單子葉植物C3H基位于葉綠體的類囊體膜。已有研究表明，毛竹C3H基因編碼蛋白很可能定位在內質網（膜）上［6］因編碼氨基酸的固有無序化分析利用在線程序FoldIndex（http：//bioportal．weizmann．ac．il/fldbin/findex）對慈竹NaC3H基因與系統發生樹中其他單子葉植物C3H基因編碼氨在基酸的固有無序化特性分析（圖8）。結果表明，這七種單子葉植物中含有兩個無序化相對保守區域，分別為NRSTQRFSRNGQDLIWADYGPHYIKV和KIIDEHAKALKESG。在系統發生樹中，親緣關系最近的慈竹、毛竹和水稻的C3H基因編碼的整個氨基酸序列中，其無序化區域個數、長度和所占比例不同。慈竹NaC3H基因編碼的整個氨基酸序列中無序化區域有4個，最長的無序化區域長度為35個氨基酸，總的無序化氨基酸數目為82個，無序化的比例達到16．0%；毛竹C3H基因的整個氨基酸序列中無序化區域有2個，最長的無序化區域長度為35個氨基酸，總的無序化氨基酸數目為60個，無序化的比例達到11．7%；水稻C3H基因的整最長的無序化個氨基酸序列中無序化區域有2個，區域長度為26個氨基酸，總的無序化氨基酸數目為52個，無序化的比例達到10．2%。由此可知，慈竹NaC3H基因編碼的整個氨基酸序列的無序化程度最高，其次是毛竹，最低的是水稻。此外，慈竹NaC3H基因的整個氨基酸序列中無序化區域比毛竹、水稻C3H基因的整個氨基酸序列中無序化區其分別為LSVAEYTWY和NRVMSET域多2個，（圖8）。。由于慈竹NaC3H基因與毛竹C3H基因有很高的相似性。因此，可以認為慈竹NaC3H基因編碼蛋白很可能也定位在內質網（膜）上。蛋白質固有無序化特性（intrinsicallydisorder-edprotein）是蛋白質功能的一個重要指標［18］。固有無序化蛋白質/區域是指體外模擬的生理條件下缺乏剛性的三維結構的蛋白質/區域，是多種動態互變結構的集合［18］。這些固有無序化蛋白質/區［14］域可能執行重要的生物學功能，而它們結構上的可塑性則可能對其行使功能具有重要意義。本研究發現，單子葉植物C3H基因編碼氨基酸序列中包含兩個無序化比較保守區域。已有研究表明，蛋而且蛋白質白質無序化區域在進化上具有保守性，無序化與有機體的復雜性密切相關染色體2n=48散生竹，［21］［19］。慈竹是大［20］型叢生竹，染色體數目為2n=72；毛竹是大型。慈竹和毛竹C3H基因編碼氨基酸序列中除都含有二個較長的無序化區域外，慈竹NaC3H基因編碼氨基酸序列中無序化區域比毛竹的多2個，由此看來，蛋白質無序化可能與有機體的復雜性密切相關。關于蛋白質無序尚需進一步深入化區域的多少對其功能有何影響，系統研究。PCR技術，本研究利用RT-克隆獲得了慈竹C3H基因全長序列（命名為NaC3H）。該序列長1581bp，編碼512個氨基酸。NaC3H基因編碼的即P450結構域。氨基酸序列中有一個保守區域，該基因已在GenBank上注冊，基因序列登錄號為JF693629。在系統發生樹中，慈竹NaC3H全長基因序列與毛竹、水稻、玉米和高粱聚為一大枝，可以看出NaC3H應屬于CYP98家族A亞家族蛋白。在NaC3H基因編碼蛋白的結構預測中，可見，NaC3H基因編碼的蛋白親水性較強；其編碼蛋白很可能定位在內質網（膜）上；其二級結構含有豐富的α-螺旋和無規卷曲，β-轉角和延伸鏈的含量可以更加直觀地看到α-螺較少；其三級結構預測，旋、β-轉角、無規卷曲和延伸鏈，以及其蛋白質折疊空間結構構象的變化；其編碼蛋白含有無序化區域。因此，利用生物信息學的方法對已知序列進行分析，可以了解其蛋白質結構和功能，為以后的試驗方案的制定提供理論依據。3討論木質素的生物合成是在一系列酶的催化下使苯丙氨酸或酪氨酸逐步轉化為木質素單體，最終聚其中C3H被認為是調控植物合成木質素的過程，體內木質素代謝過程中H單體向G/S單體轉化的，催化木質素生物合成過程中的對—香coumaroylshikimate/qui-豆酰莽草酸/奎寧酸（p-關鍵酶nate）C3位置的羥基化反應［4］。已有研究表明，雜交楊樹C3H基因的RNA干擾，抑制C3H基因表達，既能降低木質素含量又能改變木質素單體組［17］PCR技術從慈竹中克隆成。本研究室利用RT-出了C3H基因，為今后利用該基因調控大型叢生工業用竹木質素的生物合成奠定了基礎，并且對于未來提高造紙的產率也有重要的現實意義。蛋白質亞細胞定位表明，慈竹NaC3H基因編也有一部分定碼蛋白大部分定位于內質網（膜），［16］

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