硫酸銨分級沉淀

2024年3月15日發(作者：劉小楠)

一， 基本原理

硫酸銨沉淀?法可用于從?大量粗制劑?中濃縮和部?分純化蛋白?質。用此方法可?以將主要的?免

疫球從樣?品中分離，是免疫球蛋?白分離的常?用方法。高濃度的鹽?離子在蛋白?質溶液中可?與蛋

白質競?爭水分子，從而破壞蛋?白質表面的?水化膜，降低其溶解?度，使之從溶液?中沉淀出來?。

各種蛋白質?的溶解度不?同，因而可利用?不同濃度的?鹽溶液來沉?淀不同的蛋?白質。這種方法稱?

之為鹽析。鹽濃度通常?用飽和度來?表示。硫酸銨因其?溶解度大，溫度系數小?和不易使蛋?白質

變性而?應用最廣。

二， 試劑及儀器?

1 . 組織培養上?清液、血清樣品或?腹水等

2. 硫酸銨（ NH 4 ） SO 4

3. 飽和硫酸銨?溶液（ SAS ）

4. 蒸餾水

5. PBS( 含 0.2g /L 疊氮鈉 )

6. 透析袋

7. 超速離心機?

8. pH 計

9. 磁力攪拌器?

三， 操作步驟

以腹水或組?織培養上清?液為例來介?紹抗體的硫?酸銨沉淀。各種不同的?免疫球蛋白?鹽析所需硫?

酸 銨的飽和度?也不完全相?同。通常用來分?離抗體的硫?酸銨飽和度?為 33% — 50% 。

（一）配制飽和硫?酸銨溶液（ SAS ）

1.將 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 邊攪拌邊慢?慢加到 1 升 蒸餾水中。用氨水或硫?酸調到硫

酸?pH7.0 。此即飽和度?為 100% 的硫酸銨溶?液（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.

2.其它不同飽?和度銨溶液?的配制

（二）沉淀

1.樣品（如腹水） 20?000?′?g?離心 30 min ，除去細胞碎?片；

2.保留上清液?并測量體積?；

3.邊攪拌邊慢?慢加入等體?積的 SAS 到上清液中?，終濃度為 1 ： 1 （

4.將溶液放在?磁力攪拌器?上攪拌 6 小時或攪拌?過夜（ 4 ° C ），使蛋白質充?分沉淀。

（三）透析

1.蛋白質溶液? 10?000?′?g?離心 30 min （ 4 ° C ）。棄上清保留?沉淀；

2.將沉淀溶于?少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 疊氮鈉中。沉淀溶解后?放入透析袋?對

PBS -0.2g /L 疊氮鈉透析? 24-48 小時（ 4 ° C ），每隔 3-6 小時換透析?緩沖液一次?，以徹

底除去?硫酸氨；

3.透析液離心?，測定上清液?中蛋白質含?量。

四，應用提示

（一） 先用較低濃?度的硫酸氨?預沉淀，除去樣品中?的雜蛋白。

1.邊攪拌邊慢?慢加 SAS 到樣品溶液?中，使濃度為 0.5:1 (v/v) ；

2.將溶液放在?磁力攪拌器?上攪拌 6 小時 或過夜（ 4 ° C ）；3.3000?′?g?離心 30 min （ 4 °

C ），保留上清液?；上清液再加? SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次離心得?到沉淀。將沉淀溶于? PBS ，

同前透析，除去硫酸氨?；

4.上清液再加? SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次離心得?到沉淀。將沉淀溶于? PBS ，同前透析，除

去硫酸氨?；

5.雜蛋白與欲?純化蛋白在?硫酸氨溶液?中溶解度差?別很大時，用預沉淀除?雜蛋白是非?常有效

（二）為避免體積?過大，可用固體硫?酸氨進行鹽?析（硫酸氨用量?參考表 1 ）；硫酸氨沉淀?法

與層析 技術結合使?用，可得到更進?一步純化的?抗體。

今天作的實?驗是利用硫?酸銨沉淀蛋?白質，從之前作過?的經驗知道?，這一個步驟?是有名的煩

，要慢慢用敲??的把硫酸銨?緩緩的加入?蛋白質溶液?中。

相關的原理?可以在莊榮?輝學習網站?中找到，與鹽溶剛好?相反，在蛋白質溶?液中加入硫?酸銨，

會使得蛋白?質的溶解度?下降，因而沉淀出?來。因為硫酸銨?所解離的離?子容很大，所帶的電

子?數也多(NH4+, SO42-)，因此當其溶?入水中時，會吸引大量?水分子與這?些離子水合?。

蛋白質分子?表面多少有?一些較不具?極性的區域?，水分子會在?這些非極性?區的表面聚?集，形

成類似『水籠』的構造(請見下圖)，以便把蛋白?質溶入水中?。一旦蛋白質?溶液加入硫?酸銨，

后者吸引了?大量水分子?，使水籠無法?有效隔離蛋?白質的非極?性區，造成這些非?極性區之間?

的吸引，因而沉淀下?來。因此，分子表面上?若有越多的?非極性區域?，就越容易用?硫酸銨沉

淀?下來。

在計算所添?加的硫酸銨?的重量方面?，找到了一個?不錯的網站?——硫酸銨計算?機

這個網頁上?可以靠著輸?入實驗溫度?、溶液體積、想要到達的?百分濃度以?及初始的百?分濃度

這四?個數值，就可以得到?需要添加的?硫酸銨克數?，以及在加入?固體硫酸銨?后所增加的?體

積，算是一個很?不錯的網站?。

此外另一個?比較值得提?的，是我有用兩?種方式加入?硫酸銨，第一種是固?體的硫酸銨?模碎加

入，另一種是將?硫酸銨溶成?飽和溶液再?加入，各有各的優?缺點，比較如下：

1.造成蛋白質?變質的程度?：固體的硫酸?銨>硫酸銨飽和?溶液

利用硫酸銨?飽和溶液真?的超棒，滴入的速度?可以很快而?不造成變質?(沒試過用倒?入的)。 不

像固體的?硫酸銨只能?磨碎慢慢加?入，速度一快蛋?白質就壞了?(溶液有致密?的白色氣泡?產生)。

2.操作的容易?度： 硫酸銨飽和?溶液>>固體的硫酸?銨

固體硫酸銨?最大的缺點?就是操作不?容易，要一直敲敲?敲又不能太?快，所以當你要?溶解的蛋

白?質很多時，這是很累的?步驟。然而硫酸銨?飽和溶液比?較麻煩只有?在配制部分?，要先加熱

讓?它飽合后，回到操作溫?度讓它過飽?和，最后用濾紙?把硫酸銨結?晶去掉。

3.蛋白質溶液?的體積放大?程度 硫酸銨飽和?溶液>>固體的硫酸?銨

這是使用硫?酸銨飽和溶?液最頭痛的?部分，舉例來說，要讓100? ml的硫酸?銨百分比從?0%到

25%， 如果是加入?固體的硫酸?銨，只會讓溶液?從100 ml變成1?07 ml左右，但若是加入?硫酸

銨飽和?溶液，會讓溶液變?成125 ml！而且若是要?提高到50?%，須加等量的?硫酸銨飽和?溶

液，所以會讓蛋?白質溶液從?100 ml變成2?00 ml。

因此在加入?硫酸銨時，若是低百分?濃度可以利?用硫酸銨飽?和溶液，然而如果是?高百分濃度?

的，除非不在意?蛋白質溶液?體積的放大?(反正都要離?心離下來)，否則還是用?固體硫酸銨?來

的好。

所以今天從?0%拉到25%及從25%拉到50%時，都是利用硫?酸銨飽和溶?液，但是當要從?50%

拉到75%時，我選擇利用?固體硫酸銨?，因為如果用?硫酸銨飽和?溶液，

的?溶液體積。

離心機無法?離那么多