基因復制

2023年3月9日發(作者：蓮子排骨湯)DNA的復制與修復

第十六章 DNA的生物合成與修復

的復制 的修復 3.逆轉錄生成DNA











第一節 DNA的復制 top



一、半保留復制（mi-conrvation replication）

（一）證據：

1.

用氮15標記大腸桿菌DNA，然后在氮-14中培養，新形成的DNA是雜合雙鏈，即雙鏈中一條是重鏈（約重1％），一條是輕鏈。第二代則有一半全是輕鏈，一半是雜合雙鏈。

2.

大腸桿菌DNA在用氚標記的胸苷復制近兩代，放射自顯影，未復制部分銀密度低，由一條放射鏈和一條非放射鏈組成；已復制部分有一條雙鏈是放射的，一條雙鏈有一半是放射的。這證明大腸桿菌DNA是環狀分子，以半保留方式復制。

（二）特點：子代保留一條親代鏈，而不是將它分解。這說明DNA是相對穩定的。雙螺旋DNA（或RNA）是所有已知基因的復制形式。

二、復制的起點和單位

（一）基因組能獨立進行復制的單位稱為復制子。原核生物是單復制子，真核生物是多復制子。每個復制子有起點。通過測定基因出現的頻率可以確定起點位置，距離起點越近的基因出現的頻率越高。起點有發動復制的序列，也有決定拷貝數的序列。起點的結構是很保守的。

（二）復制終止點：已發現Ecoli的與復制終止有關位點，其中含有23bp的保守序列，由tus蛋白與此位點結合參與復制的終止。真核生物中似乎沒有復制終止點。

（三）復制多數是雙向、對稱的，但也有例外。通過放射自顯影可以判斷復制是雙向還是單向：先在低放射性培養基中起始復制，再轉移到高放射性培養基中，如是雙向復制，其放射自顯影圖是中間銀密度低；單向復制則為一端低。

（四）單向復制有一些特殊方式：

1. 滾動環：噬菌體φX174DNA是環狀單鏈分子，復制時先形成雙鏈，再將正鏈切開，將5’連接在細胞膜上，從3’延長，滾動合成出新的正鏈。

2.

取代環：線粒體DNA復制時是高度不對稱的，一條鏈先復制，另一條鏈保持單鏈而被取代，呈D環形狀。這是因為兩條鏈的復制起點不同，另一條鏈的起點露出才能復制。

三、有關的酶

（一）反應特點：

1. 以四種dNTP為底物

2. 需要模板指導

3. 需要有引物3’-羥基存在

4. DNA鏈的生長方向是5’-3’

5. 產物DNA的性質與模板相同

（二）大腸桿菌DNA聚合酶

1.

DNA聚合酶I：單鏈球狀蛋白，含鋅。有聚合酶活性和外切酶活性，其中3’-5’外切酶活性起校正作用，5＇-3＇活性起修復和切除引物作用。DNA聚合酶I主要起損傷修復作用。每秒可聚合10個堿基。切除氨基端5＇-3＇外切酶活性后稱為Klenow

fragment，用于引物標記等。

2. DNA聚

合酶II：單鏈，以切口雙鏈DNA為模板，作用不清楚。

3. DNA聚合酶III：起DNA復制作用，功能與聚合酶I相似。全酶共10種亞基，含鋅。每秒可聚合1000個堿基。

（三）真核生物DNA聚合酶：有a、b、g、δ、ε五種，性質與大腸桿菌的酶相似，多無外切酶活性。a相當于聚合酶III，用于引發、滯后鏈合成；b主要起修復作用，γ位于線粒體，δ合成前導鏈，但前50個堿基由a合成。

（四）DNA連接酶：使雙鏈DNA切口處的5’-磷酸和3’-羥基生成磷酸二酯鍵。需供能，細菌用NAD，動物和噬菌體用ATP，形成焦磷酸鍵的活化形式，再由3’羥基發動親核攻擊，形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌的連接酶作用于粘末端，T4的還可作用于平末端。

四、半不連續復制（mi-discontinuocos replication）

（一）復制叉由5’向3’方向連續復制，稱為前導鏈；另一條鏈復制叉由3’向5’移動，而DNA復制方向不變，形成許多不連續片段，稱為岡崎片段，最后連接成完整的DNA，稱為滯后鏈。

（二）首先由引物合成酶由5’向3’方向合成10個核苷酸以內的RNA引物，然后聚合酶III在引物3’-羥基上合成DNA，再由聚合酶I切除引物，填補空白，最后DNA連接酶將岡崎片段連接起來，形成完整DNA。

（三）復制具有高度忠實性，其錯配幾率約為10-10，從熱力學上考慮，堿基發生錯配的幾率約為10-2，酶對底物的選擇作用和校正作用各使錯配幾率下降10-2，所以體外合成DNA的錯配幾率為10-6。體內復制叉的復雜結構提高了復制的準確性，修復系統對錯配加以糾正，進一步提高了復制的忠實性。

五、解鏈

復制時必需解鏈，如靠旋轉，則大腸桿菌DNA要達到每分鐘6000轉。其實復制時是用拓撲異構酶和解螺旋酶來解鏈的。拓撲異構酶I可切斷一條鏈，牽引另一條鏈通過切口，再連接起來。每次可消除一個負超螺旋，不需要ATP。同轉錄有關。拓撲異構酶II每次引入2個負超螺旋，需要ATP。引入負超螺旋可消除復制叉前進帶來的張力，促進解鏈。解螺旋酶通過水解ATP來解開雙鏈，每對堿基需2個ATP。單鏈結合蛋白(SSB)可與解開的單鏈結合，防止復性和水解。

六、DNA復制體的結構

七、與DNA復制有關的酶和蛋白質因子由30多種，他們在復制叉上形成離散的復合物，彼此配合，進行高度精確的復制，這種結構稱為復制體。引物合成酶與另外6種蛋白構成引發體。在DNA復制叉上進行的基本活動包括：

（一）雙鏈的解開

（二）RNA引物的合成

（三）DNA鏈的延長

（四）切除引物，填補缺口，連接相鄰的DNA片斷

（五）切除和修復尿嘧啶和錯配堿基。

八、真核生物DNA的復制

（一）真核生物有核小體結構，復制速度慢，復制叉每

分鐘移動約1000－3000堿基對，而細菌約為50千堿基對。真核生物有許多復制起點，復制子只有細菌的幾十分之一，所以復制時間在同一數量級（

4.2Mb，酵母、果蠅40Kb，植物300，蛙200，鼠150Kb）。快速生長的原核生物，其復制起點可連續復制，而真核生物采取多復制起點的方法加速復制。

（二）真核生物復制時，核小體打開，組蛋白直接轉移到子代前導鏈上，滯后鏈用新合成的組蛋白。所以DNA是半保留的，而組蛋白是全保留的。真核生物岡崎片段長度約為200堿基對（

1－2Kb），相當于一個核小體的長度。

（三）真核生物的增殖周期可分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有絲分裂期（M期）等四個時相，間期為分裂期作準備，進行生物大分子和細胞器的倍增。前期合成DNA復制必須的蛋白質和RNA，復制期先復制常染色質DNA，再復制異染色質。然后進入有絲分裂的準備期。前期變動較大。分裂期后，有些細胞進入前期，開始下一個周期；有些失去分裂能力；有些脫離分裂周期，或進行分化，或進入靜止期（G0期）。成年動物大部分細胞處于靜止期。

九、DNA復制的調控

復制有復雜的調控機制。有正調節，也有負調節。有順式作用，即以某DNA序列為調控因子；也有反式作用，即以基因的產物，如蛋白質或RNA為調控因子。原核生物的復制起點與細胞膜相結合，復制與細胞膜有密切關系。真核生物復制從核膜開始，與質膜也密切相關。dnaA濃度決定起始頻率。top



第二節 DNA的修復 top



一、DNA的損傷

（一）環境作用

1. 物理因素

² 紫外線：形成嘧啶二聚體，使轉錄終止，復制受阻。

² 電離輻射：αβγX-射線等，主要通過電離作用造成損傷。可造成多種損傷，如DNA斷裂、堿基脫落、雜環破裂、氧化等。

2. 化學因素

²

烷化劑：有活潑烷基，可轉移到堿基或磷酸上，如硫酸二甲酯、芥子氣等。鳥嘌呤的O6和N7最易烷化，導致錯配(GT)或脫落。磷酸三酯不穩定，易斷裂。雙功能試劑可造成交聯。

² 堿基或核苷類似物：FU、BrdU、6-巰基嘌呤等。可競爭抑制核苷酸合成或摻入核酸導致錯配。

² 亞硝酸鹽及亞硝胺：前者造成脫氨，后者氧化后生成烷化劑和自由基。

² 代謝活化化合物：如苯并笓、黃曲霉毒素等。經混合功能氧化酶催化形成環氧化物，與核酸結合，造成突變。以上物理及化學因素統稱誘變劑。

3. 生物因素

² DNA、RNA腫瘤病毒可插入基因組，引起突變。

（二）自發性損傷

1. 復制時的堿基錯配

2. 互變異構：A＝NH時可

形成A=C，G－OH時可形成GT三鍵配對

3. 堿基脫氨：C-U，A-I，G-X

4. 堿基丟失：大腸桿菌每代丟失一個嘌呤，哺乳動物可達一萬個。嘧啶丟失幾率只有嘌呤的1／20。

二、光復活

光復活酶可被可見光（300－600納米，400納米最有效）激活，分解由于紫外線照射而形成的嘧啶二聚體。此酶廣泛存在，但人體只存在于淋巴細胞和皮膚成纖維細胞，且是次要修復方式。

三、切除修復

（一）細胞內有多種特異的核酸內切酶，可識別DNA的損傷部位，在其附近將DNA單鏈切開，再由外切酶將損傷鏈切除，由聚合酶以完整鏈為模板進行修復合成，最后有連接酶封口。

（二）堿基脫氨形成的尿嘧啶、黃嘌呤和次黃嘌呤可被專一的N-糖苷酶切除，然后用AP（apurinic/apyrimidinic，缺嘌呤或缺嘧啶）核酸內切酶打開磷酸二酯鍵，進行切除修復。DNA合成時消耗NADPH合成胸腺嘧啶，可與胞嘧啶脫氨形成的尿嘧啶相區別，提高復制的忠實性。RNA是不修復的，所以采用“廉價”的尿嘧啶。

（三）切除修復不需光照，也稱暗修復。大腸桿菌中有UvrABC系統，可切除修復嘧啶二聚體。人體缺乏相應系統則發生“著色性干皮病”，皮膚干燥，有色素沉著，易患皮膚癌。可加入T4內切酶治療。

四、重組修復



以上修復發生在復制前，稱為復制前修復。復制時未修復的損傷部分會留下缺口，通過遺傳重組進行修復：從完整的母鏈上將相應序列移至缺口處，用再合成的序列填補母鏈的空缺。此過程也叫復制后修復。重組修復中原損傷沒有除去，但若干代后可逐漸稀釋，消除其影響。所需要的酶包括與重組及修復合成有關的酶，如重組蛋白A、B、C及DNA聚合酶、連接酶等。

五、誘導修復



DNA嚴重損傷能引起一系列復雜的誘導效應，稱為應急反應，包括修復效應、誘變效應、分裂抑制及溶原菌釋放噬菌體等。細胞癌變也可能與應急反應有關。應急反應誘導切除和重組修復酶系，還誘導產生缺乏校對功能的DNA聚合酶，加快修復，避免死亡，但提高了變異率。單鏈DNA誘導重組蛋白A，可水解Lex

A蛋白，使一系列基因得到表達，如RecA、UvrABC、SOS修復所需的酶等，產生應急反應。應急反應可作為致癌物的簡易檢測方法。采用缺乏修復系統、膜透性高的突變株，并添加鼠肝勻漿液。

六、Ada蛋白

也叫適應性蛋白，可識別甲基化的DNA，將甲基轉移到自身的半胱氨酸上，不可逆，故稱“自殺修復”。可修復磷酸及鳥苷上的甲基。

七、真核細胞修復特點

1. 多聚腺苷酸－核糖化：由多聚(ADP-核糖)聚合酶催化，用NAD合成并轉移到相應蛋白上。可增加一些修復酶的活性，如連接酶。

2.



轉錄－修復偶聯：轉錄時，若模板鏈損傷，則轉錄暫停，轉錄因子TFIIS使聚合酶退回，CSA/CSB及TFIIE召集修復。若DNA雙鏈損傷，則模板鏈優先修復。top



第三節 逆轉錄生成DNA top



一、逆轉錄酶

含兩個亞基，a亞基是b亞基水解產生的。含鋅。要求有模板和不少于四個核苷酸的引物，由5’向3’合成DNA。真核生物的信使RNA加入寡聚dT后可作為模板。此酶有多種功能，可先合成DNA－RNA雜合分子，再水解RNA（RNA酶H活力），然后復制其互補鏈，形成雙鏈DNA。

二、逆轉錄過程：

以前任宿主的tRNA為引物,為復制末端,需要借助末端重復結構進行“跳躍”。

三、意義

（一）逆轉錄與細胞惡性轉化有關，為腫瘤的研究和防治提供了重要線索。艾滋病、乙肝等也有逆轉錄過程。

（二）逆轉錄病毒經過改造，可作為信息載體，用于腫瘤和遺傳疾病的基因治療。

真核生物的基因組中多含逆假基因，可能是信使RNA經逆轉錄而整合到基因組中的。所以真核生物正常細胞也存在逆轉錄過程。

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