實(shí)驗(yàn)七、血清膽固醇的定量測(cè)定（磷硫鐵法）

更新時(shí)間:2023-06-11 02:13:31 閱讀：評(píng)論：0

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掌握磷硫鐵法測(cè)定血清膽固醇的原理、方法及臨床意義。

實(shí)驗(yàn)原理：

總膽固醇的測(cè)定有化學(xué)比色法(磷硫鐵法和鄰苯二甲醛法)和酶學(xué)方法(試劑盒)兩類。本實(shí)驗(yàn)采用磷硫鐵法測(cè)定血清膽固醇含量。

用無(wú)水乙醇提取血清中的膽固醇，再與硫磷鐵試劑作用，產(chǎn)生顏色反應(yīng)，呈色度與膽固醇含量成正比，可用比色法測(cè)定血清中膽固醇含量。

血清經(jīng)無(wú)水乙醇處理，蛋白質(zhì)被沉淀，膽固醇及其酯溶解在無(wú)水乙醇。在乙醇提取液中，加磷硫鐵試劑，膽固醇及其酯與試劑形成比較穩(wěn)定的紫紅色化合物，此物質(zhì)在560nm 波長(zhǎng)處有特征吸收峰，可用比色法作膽固醇的定量測(cè)定。正常血清中膽固醇的含量有隨年齡增大而增

加的趨勢(shì)，其平均正常值在110～220mg/100ml。

膽固醇含量在400mg/100ml內(nèi)，與A（或OD）值呈良好線性關(guān)系。

實(shí)驗(yàn)講授：

722型分光光度計(jì)的使用

測(cè)量原理

分光光度法測(cè)量的理論依據(jù)是伯郎—比耳定律：當(dāng)容液中的物質(zhì)在光的照射和激發(fā)下，產(chǎn)生了對(duì)光吸收的效應(yīng)。但物質(zhì)對(duì)光的吸收是有選擇性的，各種不同的物質(zhì)都有其各自的吸收光譜。所以根據(jù)定律當(dāng)一束單色光通過(guò)一定濃度范圍的稀有色溶液時(shí)，溶液對(duì)光的吸收程度A與溶液的濃度c（g/l）或液層厚度b (cm) 成正比。其定律表達(dá)式A = abc（a是比例系數(shù)）。當(dāng)c的單位為mol/l時(shí)，A = εbc，比例系數(shù)用ε表示，稱為摩爾吸光系數(shù)。其單

位為L(zhǎng)·mol-1·cm-1，它是有色物質(zhì)在一定波長(zhǎng)下的特征常數(shù)。

T (透光率) = I/I0 A (吸光度) = -lgT 或 A = K·C·L (比色皿的厚度)

測(cè)定時(shí)，入射光I, 吸光系數(shù)和溶液的光徑長(zhǎng)度不變時(shí)，透過(guò)光是根據(jù)溶液的濃度而變化的，即“K”為常數(shù)。比色皿厚度一定，“L”、“I0”也一定。只要測(cè)出A即可算出“C”。《分光光度計(jì)的表頭上，一行是透光率，一行是吸光度。》

722型分光光度計(jì)的使用

1、將靈敏度旋鈕調(diào)至“1”檔（信號(hào)放大倍率最小）。

2、開啟電源，指示燈亮，選擇開關(guān)臵于“T”，波長(zhǎng)調(diào)至到測(cè)試用波長(zhǎng)。儀器預(yù)熱20分鐘。

3、打開試樣室（光門自動(dòng)關(guān)閉），調(diào)節(jié)透光率零點(diǎn)旋鈕，使數(shù)字顯示為000.0。（調(diào)節(jié)100%T旋鈕），蓋上試樣室蓋，將比色皿架處于蒸餾水校正位臵，使光電管受光，調(diào)節(jié)透光率100%旋鈕使數(shù)字顯示100.0。如顯示不到100.0，則可適當(dāng)增加微電流放大的倍數(shù)。（增加靈敏度的檔數(shù)同時(shí)應(yīng)重復(fù)（3）調(diào)節(jié)儀器透光率的“0”位）但盡量使倍率臵于低檔使用。這樣儀器會(huì)有更高的穩(wěn)定性。

4、預(yù)熱后，按（3）連續(xù)幾次調(diào)整透光率的“0”位和“100%”的位臵，待穩(wěn)定后儀器可進(jìn)行測(cè)定工作。

吸光度“A”的測(cè)量

將選擇開關(guān)臵于A 。調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù)字顯示為零，然后將被測(cè)樣品移入光路，顯示值即為被測(cè)樣品的吸光度值。

濃度C的測(cè)量

將選擇開關(guān)由“A”旋至“C”，將已標(biāo)定濃度的樣品放入光路，調(diào)節(jié)濃度旋鈕，使得數(shù)字顯示為標(biāo)定值，將被測(cè)樣品放入光路即可讀出被測(cè)樣品的濃度值。

使用方法

（1）預(yù)熱儀器將選擇開關(guān)臵于“T”，打開電源開關(guān)，使儀器預(yù)熱20分鐘。為了防止光電管疲勞，不要連續(xù)光照，預(yù)熱儀器時(shí)和不測(cè)定時(shí)應(yīng)將試樣室蓋打開，使光路切斷。（2）選定波長(zhǎng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)手輪，調(diào)至所需要的單色波長(zhǎng)。

（3）固定靈敏度檔在能使空白溶液很好地調(diào)到“100%”的情況下，盡可能采用靈敏度較低的擋，使用時(shí)，首先調(diào)到“1”擋，靈敏度不夠時(shí)再逐漸升高。但換擋改變靈敏度后，須重新校正“0%”和“100%”。選好的靈敏度，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不要再變動(dòng)。

（4）調(diào)節(jié)T=0% 輕輕旋動(dòng)“0%”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”，（此時(shí)試樣室是打開的）。（5）調(diào)節(jié)T=100% 將盛蒸餾水（或空白溶液，或純?nèi)軇┑谋壬蠓湃氡壬笞苤械牡谝桓駜?nèi)，并對(duì)準(zhǔn)光路，把試樣室蓋子輕輕蓋上，調(diào)節(jié)透過(guò)率“100%”旋鈕，使數(shù)字顯示正好為“100.0”。

（6）吸光度的測(cè)定將選擇開關(guān)臵于“A”，蓋上試樣室蓋子，將空白液臵于光路中，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)節(jié)旋鈕，使數(shù)字顯示為“.000”。將盛有待測(cè)溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格內(nèi)，蓋上試樣室蓋，輕輕拉動(dòng)試樣架拉手，使待測(cè)溶液進(jìn)入光路，此時(shí)數(shù)字顯示值即為該待測(cè)溶液的吸光度值。讀數(shù)后，打開試樣室蓋，切斷光路。

重復(fù)上述測(cè)定操作1-2次，讀取相應(yīng)的吸光度值，取平均值。

（7）濃度的測(cè)定選擇開關(guān)由“A”旋臵“C”，將已標(biāo)定濃度的樣品放入光路，調(diào)節(jié)濃度旋鈕，使得數(shù)字顯示為標(biāo)定值，將被測(cè)樣品放入光路，此時(shí)數(shù)字顯示值即為該待測(cè)溶液的濃度值。

（8）關(guān)機(jī)實(shí)驗(yàn)完畢，切斷電源，將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架用軟紙擦凈。

注意事項(xiàng)：

1、測(cè)量完畢，速將暗盒蓋打開，關(guān)閉電源開關(guān)，將靈敏度旋鈕調(diào)至最低檔，取出比色皿，將裝有硅膠的干燥劑袋放入暗盒內(nèi)，關(guān)上蓋子，將比色皿中的溶液倒入燒杯中，用蒸餾水洗凈后放回比色皿盒內(nèi)。

2、每臺(tái)儀器所配套的比色皿不可與其它儀器上的表面皿單個(gè)調(diào)換。

儀器：

722分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、試管及試管架、刻度吸量管或移液器等。

試劑：

（1）10％三氯化鐵溶液：10gFeCl3.6H2O (A.R) 溶于磷酸 (A.R)，定容至100ml。儲(chǔ)于棕色瓶，冷藏。

（2）磷硫鐵試劑：取10％FeCl3溶液1.5ml于100ml棕色容量瓶?jī)?nèi)，加濃硫酸 (A.R)至刻度。

（3）膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)液：準(zhǔn)確稱取膽固醇80mg，溶于無(wú)水乙醇，定容至100ml。

（4）膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：將儲(chǔ)液用無(wú)水乙醇準(zhǔn)確稀釋10倍即得。每毫升含0.08mg膽固醇。

（5）無(wú)水乙醇 (A.R)、無(wú)水乙醇 (A.R)。

操作

（1）吸取血清0.1ml于干燥離心管，先加無(wú)水乙醇0.4ml，搖勻后再加無(wú)水乙醇2.0 ml，搖勻，10分鐘后離心（3000rpm 離心5 min），上清液備用（分兩次加入乙醇的目的是使作用完全）。

（2）取干燥試管3支，編號(hào)，分別加入無(wú)水乙醇1.0ml（空白管）、膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0ml（標(biāo)準(zhǔn)管）、上述乙醇提取液1.0ml（樣品管），各管皆加入磷硫鐵試劑1.0ml，搖勻，10分鐘后，分別轉(zhuǎn)移至0.50 cm光徑的比色杯內(nèi)，用分光光度計(jì)560nm比色。

硫磷鐵試劑須沿管壁緩緩加入，與乙醇液分成兩層，立即迅速振搖20次，放臵10分鐘（冷卻至室溫）后，于560nm 進(jìn)行比色，以空白管調(diào)零讀取各管吸光度。

計(jì)算

（1）通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)求得血清膽固醇的含量。

（2）因膽固醇含量在400mg/100ml 內(nèi)，與A （或OD ）值呈良好線性關(guān)系，可由吸光

值A(chǔ) 的比值求其含量1

212C C A A =，本實(shí)驗(yàn)即用此法。（3）如按方法1使用血清為樣品，亦可根據(jù)線性關(guān)系計(jì)算

血清膽固醇mg%=20004.010008.0100/1212=

A A A A ml mg ＝血清膽固醇 A 2=標(biāo)準(zhǔn)液吸光值；A 1=樣品液吸光值

注意事項(xiàng)：

1、顏色反應(yīng)與加硫磷鐵試劑混合時(shí)的產(chǎn)熱程度有關(guān)，因此，所用試管口徑及厚度要一致：加硫磷鐵試劑時(shí)必須與乙醇分成兩層，然后混合，不能邊加邊搖，否則顯色不完全；硫磷

鐵試劑要加一管混合一管，混合的手法，程度也要一致；混合時(shí)試管發(fā)熱，注意勿使管內(nèi)液體濺出，以免損傷衣服、皮膚、眼睛。

2、所用試管和比色杯均須干燥，濃硫酸的質(zhì)量很重要，放臵日久，往往由于吸收水分而使顏色反應(yīng)降低。