湘西慈竹葉中黃酮的提取與測定

2024年2月8日發(作者：欲的近義詞)

湘西慈竹葉中黃酮的提取與測定

蔣劍波;周志剛;彭丁棟

【摘 要】設計正交試驗,以溶劑浸提-回流法提取,以分光光度法測定,研究了湘西慈竹葉中總黃酮提取和測定的方法.結果表明:溶劑、溶劑濃度、水浴溫度、回流時間4種因素對提取效果影響大小依次為,溶劑>溶劑濃度>回流時間>水浴溫度,其中溶劑及其濃度是主要因素,回流時間和水浴溫度是次要因素.不同溶劑對慈竹葉總黃酮提取效果影響大小順序為丙酮>乙醇>乙醚.浸提一回流法提取湘西慈竹葉中黃酮類化舍物的優化提取條件(固定料液比為1:20)是:以75%的丙酮為浸提劑,于70℃下回流加熱4 h.在優化提取條件下,測得湘西慈竹葉總黃酮含量為13.0 mg·g-1(春)～12.4 mg·g-1(秋),春季新葉中黃酮含量略高于秋季老葉.湘西慈竹葉總黃酮含量略低于四川南充慈竹葉.

【期刊名稱】《中國野生植物資源》

【年(卷),期】2011(030)002

【總頁數】5頁(P46-50)

【關鍵詞】湘西慈竹;天然黃酮;浸提-回流法;正交試驗

【作 者】蔣劍波;周志剛;彭丁棟

【作者單位】吉首大學生物資源與環境科學學院,湖南吉首416000;中南大學化學化工學院,湖南長沙410083;吉首大學生物資源與環境科學學院,湖南吉首416000;吉首大學生物資源與環境科學學院,湖南吉首416000

【正文語種】中 文

【中圖分類】O657.7;O658

黃酮類化合物 (flavonoid)又稱黃酮體、黃堿素,是一類以 C6-C3-C6碳架為基本特征的低相對分子質量多酚化合物,廣泛存在于自然界中,尤其是在植物界中分布最廣。研究表明,黃酮類化合物具有多種生物活性,尤其是其在臨床上治療心血管疾病的強心、擴張冠狀血管、增加冠脈血流量、抗心律失常、降壓、降低血膽固醇等作用[1]被發現以來,在國內外掀起了從各種植物中尋找和提取天然黃酮的熱潮。

20世紀 90年代以來,人們對竹葉的研究發現[2],竹葉提取物 (Ebl)具有良好的抗衰老、抗病毒及保護心腦血管、防治老年退行性疾病等生物學功效。且迄今尚未發現竹葉提取物中任何有毒、有害成分,其安全性大大高于含有有毒白果酸成分的銀杏提取物 (EGb)。進一步研究發現,以碳苷黃酮為主的黃酮類化合物是竹葉提取物中的主要功能因子。碳苷黃酮與氧苷黃酮相比具有結構穩定,不易被降解;能深入病灶部位,直接發揮療效;親水性增強等特點,有利于藥品、食品、化妝品等的開發。因此,對竹葉中黃酮的研究與開發成為人們關注的重點。

慈竹〔Sinocalam us affinis(Rendle)McClure.〕系禾本科竹亞科慈竹屬喬木型竹類,稈高 5～10 m,徑4～8 cm,原產中國,分布在云南、貴州、廣西、湖南、湖北、四川及陜西南部各地[3]。湘西地處湘、鄂、川、黔四省邊區,亦有慈竹分布。以往國內對慈竹的研究主要在其栽培技術與環境生態效應[4-5]、竹材利用技術[6]等方面,對其化學成分的研究較少。近年來,黃世德[7]等研究了慈竹瀝的化學成分,王瓊[8]等研究了慈竹構件和分株水平總黃酮含量的變化及可溶性糖的含量,余文[9]等以醇提法研究了慈竹葉片黃酮的提取工藝及在四川不同地區含量的差異。有關湘西慈竹葉中天然黃酮的提取及測定尚未見報道。本文以浸提 -回流法提取,以分光光度法測定,研究湘西慈竹中天然黃酮的含量及其在不同季節中的變化情況,以期為竹資源的開發利用,服務地方區域經濟建設提供科學參考和依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與藥品

紫外可見光分光光度計 (Lambda 6,美國 PE公司),電熱恒溫干燥箱 (DHG-9071A,上海精宏實驗設備有限公司),電子天平 (JA2003N,上海精密科學儀器有限公司),數顯恒溫水浴鍋 (HH-S1,金壇市萬華實驗儀器廠),固體樣品粉碎機 (XA-1,金壇市榮華儀器制造有限公司)索氏提取裝置;無水乙醇(AR),丙酮 (AR),無水乙醚 (AR),硝酸鋁

(AR),亞硝酸鈉 (AR),氫氧化鈉 (AR),蘆丁標準樣 (中國藥品生物制品檢定所),二次蒸餾水;慈竹葉 (采于湖南湘西吉首市砂子坳鄉,經本校資環學院劉世彪教授鑒定)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集和預處理

在竹林中隨機選擇 5叢生長發育正常、生活環境較一致的慈竹叢,在每一竹叢中選擇直徑大小相同 (4～5 cm)的慈竹各 5株,從各個方位均勻采集無傷病蟲害竹葉,于

2009年春 (4月)、秋季 (10月)各采一次。將采集的新鮮竹葉洗凈、晾干,于 60℃左右烘干至恒重,粉碎,過 40目篩,于磨口瓶中密封干燥貯存。

1.2.2 蘆丁標準液的配制及標準曲線

精確稱取蘆丁標準樣品 50.0 mg,置于 50 mL燒杯中,加少量 70%乙醇使之完全溶解,轉入 50 mL容量瓶中,再用 70%乙醇定容至刻度,搖勻,得到1.0 mg·mL-1的蘆丁標準溶液。分別吸取 0.0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL蘆丁標準溶液分別置于 50 mL容量瓶中,各加 30%的乙醇至25 mL,然后加入 5%的亞硝酸鈉溶液 1.5 mL,搖勻,放置 6 min后,再加入 10%的硝酸鋁溶液 1.5 mL,搖勻,放置 6 min,加入 4%的氫氧化鈉溶液 20 mL,稀釋至刻度,搖勻,靜置 15 min。以不加蘆丁的試劑為空白,用紫外可見光分光光度計測定 510 nm處的吸光度,繪制標準曲線。

1.2.3 慈竹葉天然黃酮提取條件正交試驗設計

固定料液比為 1∶20,選定溶劑、溶劑濃度、水浴溫度、加熱 (回流)時間 4個條件因素,按正交表L9(34)設計正交試驗,見表1。

表1 提取條件正交試驗表1 乙醇 75% 80℃ 2 h 2 丙酮 50% 70℃ 3 h 3 乙醚 100%

50℃ 4 h

1.2.4 慈竹葉天然黃酮的提取

準確稱取 5.0 g干燥慈竹葉樣品,裝入提取器中,分別按 1.2.3節中條件提取慈竹葉總黃酮,每次加熱回流至樣品瓶中液體為無色。為使實驗具有比較性,將每次提取步驟統一為:干燥粉碎竹葉 5.00 g→浸泡 (料液比 1∶20)→加熱回流→冷卻→抽濾→分離葉綠素→抽濾→濾液定容 (250 mL)。

1.2.5 慈竹葉總黃酮的測定

吸取溶液 10.0 mL于 50 mL容量瓶,在 1.2.3節正交試驗得出的優化提取條件下,按 1.2.2節方法測定樣品,并按回歸方程計算樣品總黃酮含量。

1.2.6 數據處理

用 Excel2003軟件分析處理數據。

2 結果與討論

2.1 蘆丁標準曲線及回歸方程

測得不同濃度蘆丁標準的吸光度見表2。以濃度 C為橫坐標,吸光度 A為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:A=10.553C+0.0032,相關系數 R=0.999

8,RSD=0.15%(n=3)。

表2 不同濃度蘆丁標準的吸光度10.0 0.00 0.000 2 0.5 0.01 0.1113 3 1.0 0.02

0.2110 4 1.5 0.03 0.3212 5 2.0 0.04 0.4227 6 2.5 0.05 0.5333

2.2 慈竹葉天然黃酮提取條件正交試驗結果及提取優化條件

慈竹葉天然黃酮提取條件正交試驗結果見表3。

表3 提取條件正交試驗結果1 1(乙醇 )1(75%)1(80℃) 1(2 h) 16.14 2 1

2(50%)2(70℃) 2(3 h) 12.14 3 1 3(100%)3(50℃) 3(4 h) 12.56 4 2(丙酮) 1 2 3

22.07 5 2 2 3 1 9.32 6 2 3 1 2 9.61 7 3(乙醚) 1 3 2 3.96 8 3 2 1 3 7.84 9 3 3 2

1 2.15 k1 13.61 14.06 11.20 9.20 k2 13.67 9.77 12.12 8.57 k3 4.65 8.11 8.61

14.16 R 9.02 5.95 3.51 5.59

根據正交試驗結果極差分析方法[10],通過比較四種因素不同水平間的極差 (R)和同一因素不同水平的 K值大小,可以得出,四種因素對提取效果影響大小依次為:A(溶劑)>B(溶劑濃度)>D(回流時間)>C(水浴溫度),其中溶劑及其濃度是主要因素,回流時間和水浴溫度是次要因素;A2B1D3C2為提取優化條件,即用浸提 -回流法提取湘西慈竹葉的最佳提取條件是 75%的丙酮于 70℃時回流加熱4小時。前一結論與文獻[11-12]等的結論相吻合或相接近,說明這一結論對于用溶劑 -回流法提取竹葉黃酮具有一定的普遍性。后一結論則與有關文獻有所區別。值得指出的是,在實際生產提取工藝中,為了降低能耗,提高效率,當然希望加熱時間較短為好,但本文希望得到湘西慈竹葉中總黃酮量的準確值,因此仍選擇加熱回流 4 h為最佳條件。

2.3 四種因素對慈竹葉總黃酮提取的影響

2.3.1 溶劑對慈竹葉總黃酮提取的影響

3種溶劑 (乙醇、丙酮、乙醚)對慈竹葉總黃酮提取的影響如圖1所示。圖1表明,固定其它因素不變,不同溶劑對慈竹葉總黃酮提取效果影響大小順序為丙酮 (k2A)>乙醇 (k1A)>乙醚 (k3A)。許鋼[11]比較了乙醇、甲醇、丙酮水浴和超聲提取淡竹葉中總黃酮的效果,其影響大小順序均為丙酮 >乙醇 >甲醇,袁珂[12]以乙醇、甲醇、丙酮索氏法提取高節竹葉中總黃酮時,也得到了同樣的結果。本文的結果為上述文獻提供了佐證。同時,目前關于竹葉黃酮提取的文獻中,以報道單一溶劑 (如乙醇)不同濃度對提取效果影響的居多,對不同溶劑對提取效果影響報道較少,本文研究表明乙醚對提取效果影響低于丙酮和乙醇,這一結果或許對今后竹葉黃酮提取溶劑選擇有一定參考價值。

圖1 不同溶劑對慈竹葉總黃酮提取的影響

2.3.2 溶劑濃度慈竹葉總黃酮提取的影響

同一溶劑不同濃度對慈竹葉總黃酮提取的影響見圖2。結果顯示,固定其它因素不變,當溶劑濃度從 50%向 75%變化時,慈竹葉總黃酮提取量隨濃度升高而增加,當溶劑濃度從 75%向 100%變化時,慈竹葉總黃酮提取量隨濃度升高而呈下降趨勢。這一變化趨勢與多數竹葉黃酮提取文獻的結果是相一致的,表明在提取竹葉黃酮時,欲獲得較高的提取量,需要有機溶劑和水的配合,在有機溶劑與水的共同作用下進行提取;而最佳提取效果,則與有機溶劑和水的比例有關。在本文中以 75%的溶劑濃度為最佳。

圖2 不同溶劑濃度對慈竹葉總黃酮提取的影響

2.3.3 水浴溫度對慈竹葉總黃酮提取的影響

水浴溫度對慈竹葉總黃酮提取影響的變化趨勢見圖3。圖3顯示,固定其它因素不變,當水浴溫度從 50℃向 70℃變化時,竹葉總黃酮的提取量隨溫度升高而升高,當水浴溫度從 70℃向 80℃變化時,竹葉總黃酮的提取量隨溫度升高而呈現降低趨勢。這表明,慈竹總黃酮的提取量大小與水浴溫度相關,在 50℃至 80℃范圍,存在一個最佳溫度,使得慈竹總黃酮提取量達最佳值。本文得到的最佳溫度是70℃。

圖3 水浴溫度對慈竹葉總黃酮提取的影響

2.3.4 加熱時間對慈竹葉總黃酮提取的影響

加熱時間對慈竹葉總黃酮提取影響的變化趨勢如圖4所示。圖4顯示,固定其它因素不變,當加熱時間從 2 h向 3 h變化時,慈竹葉總黃酮的提取量會略有下降,而當加熱時間從 3 h向 4 h變化時,總黃酮提取量有所增加,這一現象與文獻[13]的報道相類似。而文獻[14]的研究表明,當提取時間為 4.5 h時,竹葉總黃酮提取量會趨于下降。故在測定時選擇加熱提取時間為 4 h。

圖4 加熱時間對慈竹葉總黃酮提取的影響

2.4 不同季節湘西慈竹葉黃酮的含量

稱取春、秋季竹葉粉末各 3份,均為 5.0 g,于20倍原料重 75%丙酮溶液 70℃條件下水浴冷凝回流 4 h,至浸提溶劑為無色,脫葉綠素后定容測定總黃酮的含量,吸光度和計算結果見表4。

表4 湘西慈葉中總黃酮含量測定結果1(春) 0.5557 13.1 2(春) 0.5460 12.9 13.0

3(春) 0.5497 13.0 4(秋) 0.5247 12.4 5(秋) 0.5323 12.5 12.4 6(秋) 0.5179 12.2

結果表明,春季 (4月)新生竹葉中黃酮含量平均為 13.0 mg·g-1,秋季 (10月)老葉中黃酮含量平均為 12.4 mg·g-1。王瓊[8]對四川南充慈竹構件和分株水平總黃酮含量的變化研究發現,慈竹葉總黃酮含量隨著月份變化呈現明顯的節律性變化:總黃酮含量 1～3月較低,在 4月換葉期達到最大值,以后便迅速下降,5月份出現第一個低谷,6、7月黃酮類化合物略有增加,8月再次降低,進入 9月后又開始回升,到次年 3月都維持在較高的水平,并且最高點 4月的總黃酮含量可達 17.7529 mg·g-1。本文測得的湘西慈竹葉總黃酮含量略低于四川南充慈竹葉,但兩者處于同一數量級,并且春季新葉中黃酮含量略高于秋季老葉,這與文獻結果是相一致的。

3 結 論

3.1 固定料液比為 1∶20,選定溶劑、溶劑濃度、水浴溫度、加熱 (回流)時間 4個條件因素,按正交表L9(34)設計正交試驗,通過正交試驗,獲得浸提 -回流法提取湘西慈竹葉中黃酮類化合物的優化提取條件是:以 75%的丙酮為浸提劑,于 70℃下回流加熱4 h。

3.2 研究發現,溶劑、溶劑濃度、水浴溫度、加熱(回流)時間四種因素對提取效果影響大小依次為:A(溶劑)>B(溶劑濃度)>D(回流時間)>C(水浴溫度),其中溶劑及其濃度是主要因素,回流時間和水浴溫度是次要因素。不同溶劑對慈竹葉總黃酮提取效果影響大小順序為丙酮 >乙醇 >乙醚。

3.3 在優化提取條件下,測得湘西慈竹葉總黃酮含量為 13.0 mg·g-1(春 )～12.4

mg·g-1(秋 ),春季新葉中黃酮含量略高于秋季老葉。湘西慈竹葉總黃酮含量略低于四川南充慈竹葉。

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