培養(yǎng)基和溫度對(duì)2株治蝗綠僵菌生長(zhǎng)和毒力的影響

2024年2月13日發(fā)(作者：美術(shù)展)

培養(yǎng)基和溫度對(duì)2株治蝗綠僵菌生長(zhǎng)和毒力的影響

李樹(shù)一;雷仲仁;李傳仁

【摘 要】研究了不同培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度對(duì)治蝗綠僵菌(Metarhizium anisopliae)菌株LA和LD菌落面積、產(chǎn)孢量及毒力的影響,結(jié)果表明:LA在SMAY和PPDA培養(yǎng)基上的菌落面積較大,在SDAY上次之,在PCA上最小,且在SMAY培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最高;LD在SMAY、PPDA和SDAY培養(yǎng)基上的菌落面積較大,在PCA上較小,且也在SMAY培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最高;LA在30 ℃下生長(zhǎng)較快,而LD則在25 ℃生長(zhǎng)較快,但2種菌株均在25 ℃下產(chǎn)孢量較高;在SMAY上培養(yǎng)的LA、LD對(duì)東亞飛蝗(Locusta migratoria manilensis (Meyen))毒力較高,LT50分別是4.321 2 d和4.890 2 d.

【期刊名稱】《長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版）農(nóng)學(xué)卷》

【年(卷),期】2007(004)001

【總頁(yè)數(shù)】4頁(yè)(P4-7)

【關(guān)鍵詞】培養(yǎng)基;溫度;綠僵菌(Metarhizium anisopliae);東亞飛蝗(Locusta

migratoria manilensis (Meyen));毒力

【作 者】李樹(shù)一;雷仲仁;李傳仁

【作者單位】長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北,荊州,434025;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京,100094;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京,100094;長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖北,荊州,434025

【正文語(yǔ)種】中 文

【中圖分類】Q935;S432.44

真菌是最早被發(fā)現(xiàn)引起昆蟲(chóng)疾病的微生物，也是首先被研制成殺蟲(chóng)劑的微生物，并以其特殊的營(yíng)養(yǎng)方式、獨(dú)特的入侵方式和可行的宿存機(jī)制在害蟲(chóng)的綜合治理中表現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力[1]。近40年來(lái)，利用蟲(chóng)生真菌治蟲(chóng)受到了更高的評(píng)價(jià)。目前，真菌殺蟲(chóng)劑發(fā)展極為迅速，已經(jīng)成為微生物殺蟲(chóng)劑的重要組成部分,其中綠僵菌(Metarhizium anisopliae)被認(rèn)為是最有希望的微生物殺蝗劑之一[2]。

不同真菌或同種真菌不同菌株間在生長(zhǎng)條件上存在著較大的差異。為了弄清2個(gè)新治蝗綠僵菌菌株的生物學(xué)特性和培養(yǎng)條件，筆者研究了常見(jiàn)4種蟲(chóng)生真菌培養(yǎng)基和2個(gè)常用培養(yǎng)溫度對(duì)菌株的生長(zhǎng)和毒力的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

綠僵菌菌株LA系2000年從天津北大港東亞飛蝗(Locusta migratoria

manilensis (Meyen))上分離，菌株LD系1996年從河北大城縣長(zhǎng)翅素木蝗(Shirakiacris shirakii (.))上分離。2菌株均由中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所保存。

1.2 培養(yǎng)基

選取蛋白胨馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PPDA)、薩氏葡萄糖瓊脂+酵母膏(SDAY)、薩氏麥芽提取物瓊脂+酵母膏(SMAY)和胡蘿卜馬鈴薯瓊脂(PCA)4種固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分分別如下：PPDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g +葡萄糖20 g +蛋白胨10 g +瓊脂20 g，無(wú)菌水定容至1 L；SDAY培養(yǎng)基：葡萄糖40 g +蛋白胨10 g +酵母膏2

g +瓊脂20 g，無(wú)菌水定容至1 L；SMAY培養(yǎng)基：麥芽提取物40 g+蛋白胨10

g +酵母膏2 g +瓊脂20 g，無(wú)菌水定容至1 L；PCA培養(yǎng)基：胡蘿卜100 g +馬鈴薯100 g +瓊脂20 g，無(wú)菌水定容至1 L。

1.3 綠僵菌生長(zhǎng)量測(cè)定

將4種固體培養(yǎng)基滅菌后傾入已滅菌的培養(yǎng)皿(內(nèi)徑6 cm)中,每皿5 mL,制成平板備用。將各菌株孢子液通過(guò)研磨器充分研磨配成鏡檢單孢率為100%、濃度為1×107個(gè)/mL，用微量進(jìn)樣器吸取5 μL點(diǎn)植于培養(yǎng)基中央，每處理重復(fù)3次。置于光周期L∶D=14∶10、溫度分別為25 ℃和30 ℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，記錄產(chǎn)孢起始時(shí)間，測(cè)量第3、5、7、9和11 d的菌落直徑。

1.4 綠僵菌產(chǎn)孢量測(cè)定

培養(yǎng)12 d后，用直徑為4 mm的打孔器在菌落核心至邊緣的1/2處打孔后,和5

mL吐溫-80(0.05%)置入研磨器,研磨5 min后，鏡檢單孢率為100%時(shí)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。每處理重復(fù)3次。所得孢子濃度乘以吐溫水體積(5 mL)，再除以單位圓面積(直徑為4 mm)，所得數(shù)據(jù)為該菌株的相對(duì)產(chǎn)孢量(個(gè)/mm2)；將該相對(duì)產(chǎn)孢量乘以此菌株的菌落面積即為該菌株的絕對(duì)產(chǎn)孢量(個(gè)/皿)。

1.5 毒力測(cè)定

2006年從山東泰山采集東亞飛蝗的無(wú)病蝗蝻，室內(nèi)飼養(yǎng)至4齡大小時(shí)作為供試蟲(chóng)源。取培養(yǎng)12 d的斜面菌種，配成孢子濃度為5.2×107個(gè)/mL的油劑。用微量進(jìn)樣器吸取0.5 μL在每頭試蟲(chóng)右腹側(cè)點(diǎn)滴。每處理試蟲(chóng)25頭，均單獨(dú)飼養(yǎng)于直徑6.5 cm，高17.5 cm的塑料筒中。筒兩端安裝紗蓋通氣，筒上方約25 cm處懸掛60 W白熾燈，白天供給8 h輻射熱。環(huán)境溫度設(shè)(30±2 ) ℃。用新鮮玉米葉作食料，每天更換1次。逐日記錄死亡蟲(chóng)數(shù)，死亡蟲(chóng)體保濕培養(yǎng)，以僵蟲(chóng)且體表所產(chǎn)孢子鏡檢為綠僵菌者為罹病蟲(chóng)數(shù)。用POLO幾率分析系統(tǒng)計(jì)算LT50；用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對(duì)綠僵菌LA和LD營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

綠僵菌LA和LD菌株在4種培養(yǎng)基上25 ℃下培養(yǎng)3、5、7、9、11 d后，其菌落直徑見(jiàn)表1和表2。

表1 綠僵菌LA在不同培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)比較Table 1 Comparison of the

growth of isolate LA colony on different media培養(yǎng)基菌落直徑/cm第3d第5d第7d第9d第11dPPDA1．27±0．09bA2．07±0．09abAB3．00±0．30bB3．37±0．68bB4．03±0．83bBSDAY1．43±0．28aA2．27±0．18bB2．97±0．12abB3．33±0．12bB3．93±0．15abASMAY1．33±0．15aA2．37±0．20bB3．07±0．12bB3．43±0．15bB4．07±0．03bBPCA1．17±0．21bB1．77±0．13aA2．06±0．14aA2．60±0．04aA3．63±0．20aA

表2 綠僵菌LD在不同培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)比較Table 2 Comparison of the

growth of isolate LD colony on different media培養(yǎng)基菌落直徑/cm第3d第5d第7d第9d第11dPPDA1．80±0．06aA3．93±0．03bB4．97±0．09bB6．00±0．00aA6．00±0．00aASDAY1．60±0．06aA3．93±0．09bB4．53±0．09bB5．50±0．17aA5．67±0．17aASMAY1．57±0．03aA4．17±0．22bB5．07±0．27bB5．70±0．21aA5．97±0．03aAPCA1．2±0．22aA1．93±0．03aA2．90±0．21aA3．93±0．09bB5．03±0．21cC

LA菌株在PPDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較平緩，無(wú)菌絲快速生長(zhǎng)期，各相鄰時(shí)段間菌絲生長(zhǎng)速率差異不顯著,但整體差異極顯著(F=12.107,P=0.001)，而在SDAY、SMAY和PCA培養(yǎng)基上，整體生長(zhǎng)速度差異亦極顯著(F=28.880,P<0.001；F=27.170,P<0.001和F=36.901,P<0.001)，且第5 d出現(xiàn)生長(zhǎng)加速期。

LD菌株在PPDA(F=186.242,P<0.001)、SDAY(F=175.638,P<0.001)和SMAY(F=94.079,P<0.001)培養(yǎng)基上,第5 d生長(zhǎng)速度激增，隨后保持穩(wěn)定，而第9 d進(jìn)入第2次生長(zhǎng)高速期，隨后其菌絲生長(zhǎng)速度保持穩(wěn)定。在PCA培養(yǎng)基上(F=185.395,P<0.001)，LD在第5 d、第9 d和第11 d 3次出現(xiàn)菌絲生長(zhǎng)加速現(xiàn)

象，但菌落直徑小。

從菌絲生長(zhǎng)面積來(lái)看,LA的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)以PPDA和SMAY最適(F=3.942,P=0.044),而PCA上的菌絲面積最小。LD在4種培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)面積差異性極顯著(F=11.941,P=0.003)，且在PPDA和SMAY生長(zhǎng)面積最大,在PCA上面積最小(表3)。

表3 LA、LD在不同培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)面積的比較Table 3 Comparison of the

colony areas of isolates LA and LD colonies on different media菌株不同培養(yǎng)基下的菌絲面積/cm2PPDASDAYSMAYPCALA15．49±1．22aA12．18±0．90abA15．46±0．94aA10．53±1．74bALD28．27±0．00aA25．26±1．50aA27．96±0．31aA19．96±1．61bB

2.2 培養(yǎng)基對(duì)LA和LD產(chǎn)孢量的影響

(1)不同培養(yǎng)基對(duì)LA、LD相對(duì)產(chǎn)孢量的影響 25 ℃培養(yǎng)12 d后,綠僵菌LA和LD在4種培養(yǎng)基上相對(duì)產(chǎn)孢量差異性顯著(F=27.232,P<0.001和F=4.937,P=0.032),2個(gè)菌株均在SMAY培養(yǎng)基上相對(duì)產(chǎn)孢量最高，且綠僵菌LA在SMAY和PPDA培養(yǎng)基上相對(duì)產(chǎn)孢量極顯著高于其在SDAY和PCA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量(圖1)。

(2)不同培養(yǎng)基對(duì)LA、LD絕對(duì)產(chǎn)孢量的影響 在各菌種25 ℃下培養(yǎng)12 d后，LA、LD在各培養(yǎng)基上絕對(duì)產(chǎn)孢量均差異顯著(F=51.197,P<0.001和F=5.524,P=0.024)(圖2)，且LA、LD均在SMAY培養(yǎng)基上絕對(duì)產(chǎn)孢量最高且顯著高于其在培養(yǎng)基PCA上的絕對(duì)產(chǎn)孢量。

圖1 LA、LD在不同培養(yǎng)基上的相對(duì)產(chǎn)孢量Figure1 Relative conidia

production of LA and LD isolates on different media

圖2 LA、LD在不同培養(yǎng)基上的絕對(duì)產(chǎn)孢量Figure2 Absolute conidia

production of LA and LD isolates on different mediua

2.3 溫度對(duì)菌株LA和LD的影響

表4 不同溫度下LA和LD的菌落直徑Table 4 The colonies diameters of LA

and LD isolates菌株溫度/℃菌落直徑/mm第3d第5d第7d第9d第11dLALD

253025

3013．3323．6730．6734．3340．67±0．13aA9．6720．3330．3336．6746．67±0．12bB15．6741．6750．6757．0059．67±0．33aA

13．6725．3336．6747．3347．33±0．93bB

(1)溫度對(duì)LA、LD營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響 在25 ℃和30 ℃下，LA、LD在SMAY培養(yǎng)基上的菌落直徑測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表4。

對(duì)第11 d的菌落直徑進(jìn)行t檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，LA在30 ℃菌落生長(zhǎng)直徑顯著性大于25 ℃環(huán)境下菌落直徑(t=0.756,v=4,P=0.002)，說(shuō)明綠僵菌LA更適宜在30 ℃下生長(zhǎng)。2種溫度對(duì)綠僵菌LD影響差異亦顯著(t=6.002,v=4,P=0.004)，25 ℃更適宜LD的生長(zhǎng)。

(2)溫度對(duì)LA和LD產(chǎn)孢量的影響 在25 ℃和30 ℃2種溫度下，LA和LD在SMAY培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量及初始產(chǎn)孢時(shí)間有明顯分化(表5),LA在30 ℃下產(chǎn)孢更早，但相對(duì)產(chǎn)孢量較25 ℃略低，t檢驗(yàn)表明二者差異性不顯著(t=2.121,v=4,P=0.101)。綠僵菌LD同樣在30 ℃產(chǎn)孢更早，但相對(duì)產(chǎn)孢量顯著低于其在25 ℃下產(chǎn)孢量(t=3.374.,v=4,P=0.008)。

表5 溫度對(duì)LA和LD產(chǎn)孢的影響Table 5 Effect of different temperatures on

conidia productions of LA and LD isolates菌株溫度/℃初始產(chǎn)孢時(shí)間/d相對(duì)產(chǎn)孢量/(106個(gè)/mm2)LALD 253025

303．39．55±0．92aA3．08．49±0．53aA4．38．76±2．11aA

4．01．64±0．10bB

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)綠僵菌LA和LD毒力的影響

在SMAY和SDAY培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的LA和LD孢子粉，配成同濃度油劑接種4齡東亞飛蝗若蟲(chóng)，發(fā)現(xiàn)SMAY培養(yǎng)基上的綠僵菌LA、LD具有更強(qiáng)的毒力(表6)。

表6 不同培養(yǎng)基對(duì)LA和LD毒力的影響Table 6 Virulence of isolates LA and

LD colonies on different media菌株培養(yǎng)基斜率LT50(95%置信限)/dLT90(95%置信限)/dLASMAY9．901±1．4734．321(3．976～4．644)5．886(5．126～7．902)LASDAY17．329±3．2474．782(4．250～5．346)5．669(5．140～7．856)LDSMAY7．746±0．9954．890(4．512～5．255)7．158(6．522～8．212)LDSDAY13．810±2．2765．262(4．626～5．879)6．515(5．842～8．915)

3 討論

不同昆蟲(chóng)寄主、不同氣候條件中分離到的大量綠僵菌具有不同的寄主范圍，對(duì)不同的環(huán)境具有不同的致病力，在田間防治表現(xiàn)出不同的防治效果。這些差異的存在是由它們各自不同的生物學(xué)習(xí)性所決定的，因此研究菌株的生物學(xué)特性是進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用綠僵菌生物防治的基礎(chǔ)。

本研究所選的4種培養(yǎng)基中，SMAY有利于綠僵菌LA和LD的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，同時(shí)由于SMAY培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株對(duì)東亞飛蝗的毒力較由SDAY培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株更強(qiáng),因此治蝗菌株LA和LD用SMAY培養(yǎng)基培養(yǎng)，以免續(xù)代培養(yǎng)的過(guò)程中出現(xiàn)菌株退化和毒力下降等問(wèn)題。

本研究結(jié)果顯示，LA較耐高溫，在30 ℃下的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)孢時(shí)間早，且產(chǎn)孢量在25 ℃、30 ℃ 2種溫度下無(wú)差異，因此LA培養(yǎng)溫度為 30 ℃;LD在25 ℃條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量均顯著優(yōu)于其在30 ℃下的2指標(biāo)，所以LD的培養(yǎng)溫度為25 ℃。

治蝗綠僵菌菌株LA和LD對(duì)東亞飛蝗均具有很強(qiáng)的殺蟲(chóng)能力，是值得工業(yè)開(kāi)發(fā)的

微生物殺蟲(chóng)劑資源，具有較大的開(kāi)發(fā)利用前景。本研究初步探討了4種常見(jiàn)培養(yǎng)基和2個(gè)培養(yǎng)溫度對(duì)2個(gè)菌株生長(zhǎng)和毒力的影響，其培養(yǎng)條件和繼代培養(yǎng)后的局變規(guī)律仍值得進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]徐偉松，李建豐，胡美英．昆蟲(chóng)病原真菌在害蟲(chóng)防治上的應(yīng)用[J]．廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003， (6)：51～52.

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