槲皮素調控AMPK活性誘導HL-60細胞自噬與凋亡

2024年4月2日發(作者：繁衍什么意思)

第39卷第4期中山大學學報（醫學版）

2018年7月JOURNALOFSUNYAT?SENUNIVERSITY（MEDICALSCIENCES）

Vol.39

July2018

No.4

槲皮素調控AMPK活性誘導HL-60細胞自噬與凋亡

肖潔，尹松梅，謝雙鋒，李益清，聶大年，馬麗萍，王秀菊，吳裕丹，劉紅云

（中山大學孫逸仙紀念醫院血液內科，廣東廣州510120）

摘要：

【目的】觀察槲皮素對急性髓系白血病HL-60細胞凋亡與自噬的影響及腺苷酸活化蛋白激酶

（AMPK）活性的變化，探討槲皮素抗白血病的分子機制?！痉椒ā苛魇郊毎麅x、電鏡、蛋白質印跡法檢測槲皮素孵

育HL-60細胞24、48h后細胞凋亡與自噬的水平；檢測槲皮素作用后HL-60細胞AMPK、p-AMPK的表達；流式、

蛋白質印跡法檢測不同濃度槲皮素與AMPK小分子抑制劑CompoundC共同孵育HL-60細胞后AMPK活化的情

況及細胞凋亡、自噬的變化?！窘Y果】槲皮素可誘導HL-60細胞發生凋亡，且細胞凋亡率與槲皮素濃度、作用時

間呈正相關。槲皮素濃度越大，細胞凋亡率越高（P=0.000）；隨著作用時間的延長，細胞凋亡率進一步增加（P=

0.000

熒光標記自噬體后用流式細胞儀對熒光強度進行檢測，

）；不同濃度槲皮素（25和50μmol/L）與HL-60細胞共同孵育

結果發現槲皮素作用后細胞內綠色熒光強度明顯較對照

24h及48h后，電鏡觀察到自噬體形成；綠色

組增加（P=0.001）；Westernblot檢測LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高（P<0.001）；證實槲皮素能夠誘導HL-60細胞發生自

噬。槲皮素能夠濃度依賴性的激活AMPK活性，使得AMPK的磷酸化水平增高（P=0.001）。槲皮素與Compound

C

皮素

聯合用藥組與單用槲皮素組比較，

+CompoundC組與單用槲皮素組比較，

p-AMPK

細胞凋亡率下降

的表達降低，Compound

（P<0.001

C能夠阻斷槲皮素誘導的

）；抑制AMPK的活性后，

AMPK

槲皮素誘導細胞

磷酸化。槲

凋亡的作用減弱。槲皮素+CompoundC組LC3Ⅱ/Ⅰ比值低于單用槲皮素組（P<0.001）；抑制AMPK的活性后，槲

皮素誘導細胞自噬的作用減弱?！窘Y論】槲皮素通過誘導HL-60細胞凋亡與自噬發揮抗白血病作用，AMPK可能

是槲皮素誘導細胞凋亡與自噬的重要信號分子。

關鍵詞：

槲皮素；急性髓系白血??；凋亡；自噬；腺苷酸活化蛋白激酶

中圖分類號：R733.71

文獻標志碼：

A

文章編號：

1672-3554（2018）04-0501-09

QuercetinModulateAMPKActivityandInduceApoptosisandAutophagyinHL-60Cells

XIAOJie

1

，YINSong-mei

1

，XIEShuang-feng

1

WUYu-dan

，LIYi-qing

1

，NIEDa-nian

1

，MALi-ping

1

，WANGXiu-ju

1

，

1

，LIUHong-yun

1

（DepartmentofHematology，SUNYat-nMemorialHospital，SUNYat-nUniversity，Guangzhou510120，China）

Abstract：

【Objective】Toexploretheanti-leukemiamechanismofquercetinthroughobrvingapoptosisand

autophagy

effect

cytometry

ofquercetin

ofHL-60

，Western-blot

on

cells

apoptosis

andexamining

andelectron

andautophagy

theexpressions

microscopy.

in

The

human

proteins

acute

ofAMP-

expression

myeloid

activated

leukemia

protein

ofAMPK，

HL-

kina

p-AMPKin

60cells

（AMPK

HL-60

were

）.

detected

【Methods

cells

by

】

flow

The

n-blotandflowcytometrywereudtotesttheAMPKandp-AMPK

incubated

expressions

inhibitor

andthechangofapoptosisandautophagyinHL-60cells，

were

microscopy

both

（Compound

the

inHL-60

majorfactors

C）.【Results】Quercetininducedcellapoptosis.

which

Thequercetin

wereincubated

concentrations

withquercetin

andtime

and

of

AMPK

action

cellswhich

affecting

were

the

incubated

apoptosis

with

of

different

HL-60

concentrations

ophagosomes

ofquercetin（25

were

，50

obrvated

μmol/L）for

by

24

electron

hand

收稿日期：2018-03-12

基金項目：廣東省基礎與應用基礎研究專項（2016A030313270）；廣東省醫學科研基金（A2016070）

作者簡介：肖潔，博士，主治醫師，研究方向：血液腫瘤的防治，E-mail:xiaojie3@；尹松梅，通信作者，E-mail:yinsongmei@

502

中山大學學報（醫學版）第39卷

48

control

significant

groups

difference

andthe

of

different

autophagy

concentration

fluorescence

quercetin

intensitywhich

groups

were

（P=

analyzedbyflowcytometryweresignificantamongthe

phosphorylation

among

Compound

of

the

AMPK

control

in

group

HL-60

and

cells

thedifferentconcentrationquercetin

0.001）.

groups

Thedifference

（P<0.001

ofLC3Ⅱ/Ⅰ

）.Quercetin

ratios

activated

werealso

the

inducedby

C

quercetin

，CompoundCcannotonlyinhibit

（P=

the

0.001

phosphorylation

）.WhileHL-60

ofAMPK

cellswere

，but

incubated

alsothe

both

apoptosis

with

and

quercetin

autophagy

and

modulatedtheactivity

in

ofAMPK.

HL-60cells.【Conclusions】QuercetininducedapoptosisandautophagyinHL-60cellsthrough

Keywords：quercetin；acutemyelocyticleukemia；apoptosis；autophagy；AMP-activatedproteinkina

［JSUNYat?nUniv（MedSci），2018，39（4）：501-509］

急性髓系白血病是成年人血液系統最常見的人AMPKalpha1+AMPKalpha2單克隆抗體、兔抗

惡性腫瘤之一。為提高急性白血病的治愈率，延人單克隆

長患者生存，要不斷尋找針對腫瘤細胞的新型藥

物。槲皮素摩爾分子質量為

pha2（phospho

AMPK

T172

alpha

）抗體、

1（phospho

兔抗人LC3B

T183）

抗體、

+AMPK

鼠抗人

al?

O

302.238g/mol，分子

式為C

GAPDH

157

物，幾乎無毒性，

H

10

。其是一種植物來源的黃酮類化合

因其強抗氧化性和抗癌功效，多

1.2細胞分離與培養

單克隆抗體購自英國Abcam公司。

年來受到廣泛關注。槲皮素被認為是一種“分子

靶向藥物”，可以干擾腫瘤細胞的信號轉導通路，

3%

37℃

谷

HL-60

、

氨

5%

酰

細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清、

調節分子轉導通路的關鍵靶點使細胞死亡

［1-2］

。

CO

胺的RPMI1640完全培養基中，置于

2

換液

細胞培養箱中培養，每2～3d傳代

凋亡和自噬的調控與腫瘤發展密切相關，而腺苷

酸

1.3

1

研究方法

次，取處于對數生長期的細胞進行實驗。

AMPK

活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkina

1.3.1

凋亡細胞

流式細胞儀

取濃度為

AnnexinV-FITC+Pl

0、25、50和100μmol/L

染色法檢測

槲皮

謝異?？烧T發細胞凋亡及自噬。前期的研究結果

）是調控細胞能量代謝的關鍵分子，能量代

，

素孵育

證實槲皮素能夠誘導HL-60細胞內Bcl-2的表

達，升高Bax的表達，使Bax同源二聚體形成增多，

10min（

24

r=

、

15

48

cm

h的

），

HL-60

PBS洗滌兩次后重懸，

細胞，2000r/min

調整細

離心

胞密度為

激活凋亡信號通路下游靶蛋白Caspa-3，誘導凋

亡

［3］

。而槲皮素對急性髓系白血病自噬的影響目

μLAnnexinV-FITC

1×10

6

/mL

，2.5

。取細胞懸液

μLPI。避光孵育

50μL，

30

加入

min

5

流式細胞儀測定細胞凋亡率。早期凋亡細胞

，

前尚未見相關研究報道。本研究將槲皮素作用于

HL-60

nexinV-FITC

影響，觀察槲皮素孵育后

細胞，觀察其對HL-60

HL-60

細胞凋亡及自噬的

細胞腺苷酸活化

FITC

（

An?

蛋白激酶（AMPK）的活性變化，探討槲皮素誘導

1.3.2

（+）

透射電鏡檢測槲皮素對

PI（+）

+

。

）PI（-），晚期凋亡細胞AnnexinV-

影響

收集對數生長期的HL-60

HL-60

細胞，

細胞自噬的

凋亡與自噬可能的分子機制。

min

1000r/

1材料與方法

重懸細胞，

離心5min（

10

計數，

r

接種于

=15cm

6

）

孔板，

，去上清。完全培養基

每孔接種細胞1×

6

個。槲皮素設高濃度組（50μmol/L）、低濃度組

（25μmol/L）。在相同實驗條件下，各處理組細胞

1.1

在培養箱中共同孵育24h及48h，每組設3個平

人急性髓細胞白血病細胞

細胞株與主要試劑

HL-60購于中國醫

行孔。1000r/min離心5min（r=15cm），收集細

學科學院血液學研究所。槲皮素、3-Methyladenine

胞，

購自美國SigmaChemical公司；Compoundc購自德

國Merck公司；RPMI1640培養基購自美國Gibcol

30%

2.5%戊二醛4℃固定，1%

次

、50%、70%、80%、90%、95%

鋨酸固定

的酒精各

20

1次，

min

每

。

公

AnnexinV-FITC

司；自噬檢測

試劑盒購自美國

試劑盒購自英

Bender

國Abcam

公司；

公

鼠抗

司；

3

2

丙酮浸泡

5min；100%

次，每次1

1

h

h

丙酮2次，每次10min。1/3樹脂+2/

，

；

第

2/3

3次過夜。用環氧樹脂以倒扣包

樹脂+1/3丙酮浸泡1h；純樹脂

第4期

肖潔，等.槲皮素調控AMPK活性誘導HL-60細胞自噬與凋亡

埋法進行包埋。在烤箱中70℃聚合24h。常規

修塊，

AMPK

503

200

超薄切片機切片。超薄切片厚子抑制劑

蛋白的表達變化。并觀察加入

CompoundC后槲皮素對細胞內

AMPK

AMPK

小分

1h。雙蒸水洗

～300網孔的鎳網上。置

3次，每次10

1%

min。

H

80nm，載于

2

5%

O

2

內

醋酸鈾

10min

（雙

至

及

蒸水配制）染5min，然后用雙蒸水洗。枸櫞酸鉛

1.3.6

p-AMPK

和蛋白質印跡法檢測

流式細胞儀

表達影響的變化。

AnnexinV-FITC+Pl

CompoundC抑制

染色法檢測

AMPK活

染色

1.3.3

5min

流式細胞儀檢測自噬信號

，雙蒸水洗凈。透射電鏡觀察。

取6孔細胞培

性后槲皮素對凋亡及自噬的影響

實驗分為對照

組、槲皮素（25μmol/L）組、槲皮素（50μmol/L）組、

養板，每孔細胞密度為1×10

6

cells/mL

（25

。實驗分組

槲皮素（25μmol/L）

Rapa

為槲皮素（50μmol/L）組、槲皮素μmol/L）組、

μmol/L

異性抑制

）+Compound

+Compound

AMPK的活化后，

C組，觀察采用

C組及槲皮素

槲皮素對凋亡及自噬

Compound

（

C

50

特

mmol/L

（1

）

μmol/L

、槲皮素

）

（

組、

50

Rapa

μmol/L

（1

）

μmol/L

+3-MA

）

（

+

5

3-MA

mmol/L

組

）

（

組

5

的影響，明確槲皮素誘導HL-60細胞凋亡與自噬

及槲皮素（25μmol/L）+3-MA（5mmol/L）組。在相

中的分子機制。

同實驗條件下，各處理組細胞在培養箱中共同

孵育

1.4

計量資料的描述用均數

統計學方法

±標準差表示（x±s）。

min

緩沖液洗滌細胞

離心

24h

5

，

min

每組設

（r=

3

2次，

15

個平行孔。室溫下，

cm

小心移除上清液。細胞重

）收集細胞。用1

1

×

000

檢測

r/

多組計量資料間均數比較采用單因素方差分析或

者兩因素方差分析，

懸于含有5%胎牛血清的250μL細胞培養基中。

在每個樣本中加入自噬檢測試劑250μL，混合后

LSD-t檢驗進行多重

若組間比較存在差異，

比較；所有數據應用

則采用

SPSS

避光，室溫下孵育30min。室溫下，1000r/min離

學意義。

19.0統計軟件處理，檢驗水準定為P<0.05有統計

心5min（r=15cm），收集細胞，在1×檢測緩沖液

中洗滌2次。用500μL新鮮1×檢測緩沖液重懸

細

min

胞

。

。

1×

在

檢測緩沖液中洗滌

40g/L多聚甲醛溶

3次。在流式分析儀

液中孵育細胞20

2結果

中，選擇綠色（FL1）通道分析樣本。

2.1

分別用

槲皮素對

0、25

HL-60

、50、100

細胞凋亡的影響

μmol/L槲皮素孵育HL-60

1.3.4

表達

蛋白質印跡法檢測細胞中

收集終濃度為0、25、50、100

LC3Ⅱ/Ⅰ

μmol/L

蛋白的

細胞24h及48h后，流式細胞儀雙染法檢測凋亡

槲皮素

率。采用多因素方差分析進行統計后得出：槲皮

孵育48h的HL-60細胞提取總蛋白。測定蛋白濃

素可誘導HL-60細胞發生凋亡，且細胞凋亡率與

度

槲皮素濃度、作用時間均相關。槲皮素濃度越大，

PAGE

后每

細胞凋亡率越高（F=267.81，P=0.000）；隨著作用

閉

后轉移到

孔按50

PVDF

μg蛋

膜上，

白上樣

5%

。

的脫脂奶

將蛋白經SDS-

時間的延長，細胞凋亡率進一步增加（F=214.47，

1∶

1

1

h

000

后，

，

加入含一抗的封閉液中

轉膜條件：300mA恒

（

流

LC3

轉

：稀釋比例

37℃封

AMPK：稀釋比例1∶1000，轉膜條件：300

膜

mA

15

恒流

min；

P=0.000）；時間和藥物濃度兩因素存在交互效應

（

轉膜62min；p-AMPK：稀釋比例1∶1000，轉膜條

件：300mA恒流轉膜64min），4℃搖床孵育過

2.2

F=16.88

槲皮素對

，P=

HL-60

0.01；表

細胞自噬的影響

1，圖1）。

夜。用

HRP標記的羊抗鼠

TBST將PVDF

IgG

膜洗

單抗或羊抗兔

3次后放入含

IgG

1∶

單抗封

10000

噬

2.2.1

將不同濃度的槲皮素

電鏡觀察槲皮素誘導

（25

HL-60

μmol/L、

細胞發生自

50μmol/L）

與

閉液中，室溫輕搖1h。洗滌后進行發光鑒定，并

用凝膠分析軟件對圖象進行分析。

48

HL-60

察槲皮素作用前后的細胞，

h收集細胞，

細胞進行共培養，

經戊二醛固定

分別于培養后

發現槲皮素處理組細

（不吹懸）后，電鏡觀

24h及

1.3.5蛋白質印跡法檢測槲皮素加或者不加

胞內可觀察到雙層膜泡結構，即自噬體（圖2）。

AMPK

AMPK

抑制劑CompoundC

2.2.2

細胞內熒光強度

綠色熒光標記自噬小體，流式細胞儀檢測

組、槲皮素

、p-AMPK

作用后HL-60細胞中

（25μmol/L

蛋白表達的變化

）組及槲皮素

實驗分為對照

雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）是

（50μmol/L）

目前實驗常用的自噬誘導劑。本實驗將細胞分為

組，觀察槲皮素孵育48h后細胞內AMPK、p-

空白對照組、陽性對照組（1μmol/LRapa）、低濃度

504

中山大學學報（醫學版）第39卷

表1

槲皮素對HL-60細胞凋亡的影響

Table1

TheapoptosisratesofHL-60cellsincubationwithquercetin（n=6）

0

Quercetin/(μmol/L)

24

25100

FP

48

h

5.09±

0.52

0.85

14.18

30.80

±

±

3.37

1.06

26.20

50

32.26

75

h

4.82±

40.22

±

±

1.51

0.9950.18

±

±

2.63

4.20

41.29

67.50

±

±

4.28

4.38203.92

80.040.00

0.00

A

B

80

Quercetin0255075

1）1

100

）

μmol/L

s

60

24

48

h

h

n

a

e

m

%

l

/

e

60

t

1）

a

r

s

）

1）

a

n

i

g

40

r

a

i

m

s

o

40

1）

1

d

t

p

e

t

o

a

p

A

20

m

20

i

t

s

0

1）

E

24h48h

C

0

D

0

Quercetin/

2550

（μmol/L

75

）

100

（

24

+）

h

.

（

The

a：

A）

Quercetin

and

apoptotic

48h

0

（

rates

μmol/L

B）.The

ofHL-60

，

early

b：Quercetin

apoptosis

cellswere

25

was

detected

μmol/L

defined

by

，c

as

flow

：Quercetin

PI（

cytometry

-）AnnexinV-FITC

afterthecells

50μmol/L，d：

（

Quercetin

+）

incubated

；thelate

with

75μmol/L

apoptosis

quercetin

，e

was

（

：Quercetin

defined

0，25，

as

50

100

PI

，

μmol/L.

（

75

+）

，100

AnnexinV-FITC

μmol/L）for

C：Apoptosis

rates

jor

rreprentsmeanvaluesof

cant

factors

between

which

the

affected

twofactors

the

，

apoptosis

quercetin

of

concentrations

HL-60cells，

圖1槲皮素作用

and

1）P

times

<0.001.

rcetinconcentrationisoneofthema?

24

of

h

action

D：

及48

，

Interaction

h

P

后

<0.01.

effectcontourmapshowsthattheinteractionixtremelysignifi?

HL-60細胞凋亡率變化

Fig.1TheapoptosisratesofHL-60cellsincubationwithquercetin

槲皮素（25μmol/L）組、高濃度槲皮素（50μmol/L）

組。將細胞與藥物共同作用24h，加入自噬檢測

pa

均熒光強度差異顯著

）組、Rapamycin（1μmol/L

（F=30.13

）+3MA

，P

（

=

5

0.001

mmol/L

）。各組

）組平

試劑，采用流式細胞儀檢測上述各組細胞中平均間多重比較得出以下結論：Rapa可誘導細胞發生

自噬熒光強度，采用單因素方差分析進行統計，結自噬，與空白對照組比，細胞內平均自噬熒光強度

果發現對照組、1μmol/L雷帕霉素（Rapamycin，Ra?高于空白對照組（P=0.001）。3-MA預處理細胞

第4期

肖潔，等.槲皮素調控AMPK活性誘導HL-60細胞自噬與凋亡

505

Quercetin25μmol/LQuercetin50μmol/L

槲皮素（50μmol/L）組與空白組比較，差異有統計

學意義（P<0.001）。加或不加自噬抑制劑3-MA

（5mmol/L），槲皮素誘導的細胞自噬有明顯變化，

自噬抑制劑3-MA能夠抑制槲皮素誘導的細胞自

24h

噬

2.2.3

（圖3B）。

細胞中

蛋白免疫印跡法檢測槲皮素處理后

LC3Ⅱ/Ⅰ的變化

LC3是目前最明確貫穿

HL-60

整個自噬過程并能出現在晚期自噬溶酶體中的自

噬相關蛋白，自噬激活時，LC3-Ⅰ在泛素樣反應

48h

酶的作用下與磷脂酰乙醇胺偶聯生成

LC3-Ⅰ

LC3-Ⅱ

外膜。LC3Ⅱ/Ⅰ

定位于胞質內，

比值的變化能夠反應細胞內自噬

LC3-Ⅱ定位于自噬體的內

。

水平的高低。將細胞分為空白對照組、槲皮素

（25μmol/L）組、槲皮素（50μmol/L）組、槲皮素

圖2槲皮素誘導HL-60細胞內自噬小體生成

Fig.2QuercetininducedautophagyinHL-60cells

（

μmol/L

25μmol/L

收集各組細胞，

）+3-MA

）+3-

（5

MA

mmol/L

（5mmol/L

）組。藥物處理

）組及槲皮

24

素（

h

50

后

后，Rapa誘導的細胞自噬被抑制，與Rapa組比較，

差異有統計學意義（P<0.001）；與空白對照組比較

Ⅱ/Ⅰ

差異無統計學意義（P=0.70，圖3A）。

μmol/L

的

）

變

組、

化

槲皮素

。

Western

結果

（50

表

blot

明

μmol/L

，

檢測各組細胞中

對

）

照

LC3

組各組之間

組、槲皮素（

LC3

25

μmol/L

自噬平均熒光強度在對照組、槲皮素（25

Ⅱ/Ⅰ

素處理后細胞內

比值存在差異

LC3Ⅱ/Ⅰ

（F=79.79

比值明顯高于空白對照

，P=0.000），槲皮

組，且隨著槲皮素濃度的增高，細胞內LC3Ⅱ/Ⅰ比

有統計學意義

）組及槲皮素

（F=

（

42.24

50μmol/L

，P<0.001

）組各組間的差異

）。槲皮素誘

值增高更明顯。加入自噬抑制劑

HL-60

3-MA

導后HL-60細胞內平均自噬熒光強度均高于空白

對照組，且隨著槲皮素濃度的增高，誘導自噬的效

應更加明顯。組間多重比較，槲皮素（25μmol/L）

60細胞

細胞

24

4

h，

h

細

后，

胞

再予不同濃度槲皮素孵育

預處理

內LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低（

HL-

組與空白組比較，差異有統計學意義（P=0.01）；

0.000

P=

所抑制

）

（

，證明槲皮素誘導的細胞自噬能夠被

表2，圖4）。

3-MA

）

y

100

2）

1

3）

y

g

150

4）

5）

g

a

a

h

6）

h

p

p

o

o

t

t

80

u

u

a

a

f

f

o

100

o

y

y

60

t

i

t

i

s

s

n

n

e

e

t

t

40

n

n

i

50

i

n

n

a

a

e

e

M

20

Rapa

0

A

M

3-MA

-

-

+

-

+

+

Quercetin

0

B

3-MA

-

-

25

-

50

-

-

+

25

+

50

+

0.01vs

A：

control

HL-60

group

cells

；3

treated

）P=0.000

with1

vs

μmol/L

Rapa+3-MA

Rapamycinor

group.

both

B：HL-60

with3-MA

cellsuntreated

for24h（

or

n=

treated

3）.1）

with

F=

quercetin

30.13，

（

P

25

=

，

0.001

50μmol/L

among

）

each

orboth

group

with

；2

3-MA

）P=

0.001

for48

，

h

5

（

）P

n=

=

3

0.002

）.The

vs

difference

quercetin25

are

μmol

significant

/Lgroup

between

，6）P

the

<0.001

groups

vs

which

quercetin

were

50

treated

μmol/L

with

group.

differentconcentrationsofquercetin，4）F=42.24，P<

圖3流式細胞儀檢測各組細胞平均熒光強度

Fig.3Flowcytometry-badprofilingofautophagydetectioninHL-60ells

506

中山大學學報（醫學版）第39卷

表2各組HL-60細胞中LC3Ⅱ/Ⅰ水平變化

Table2TheratioofLC3Ⅱ/ⅠinHL-60cells

Control

LC3Ⅱ/Ⅰ0.92±0.173.59

25

Quercetin/(μmol/L)

±0.70

1）

5.20

50

5mmol/L3MA+Quercetin/(μmol/L)

±0.42

1）

1.20±

25

0.20

2）

2.03±

50

0.60

3）

n=3，1）F=79.79，P<0.001amongdifferentconcentrationsofquercetingroups；2）P<0.001vsthesinglequercetin（25μmol/L）group；

3）P=0.000vsthesinglequercetin（50μmol/L）group.

表3槲皮素對HL-60細胞中p-AMPK/AMPK表達的影響

Table3TheeffectofQuercetinontheratioofp-AMPK/AMPKinHL-60cells

Control

Quercetin/(μmol/L)CompoundC25μmol/L+Quercetin/(μmol/L)

p-AMPK/AMPK0.44±0.121.08

25

±0.11

1）

1.30

50

±0.02

1）

0.56±

25

0.11

2）

0.43±

50

0.14

3）

n=3，1）F=48.84，P<0.001amongdifferentconcentrationquercetingroups；2）P=0.000vsthesinglequercetin（25μmol/L）group，3）P<

0.001vsthesinglequercetin（50μmol/L）group.

1）

2）

1）

2）

6

2）

u

2）

a

1.5

/

o

i

t

u

a

r

a

/

o

K

i

t

a

4

P

1.0

r

M

A

I

/

/

I

K

I

3

C

L

2

P

M

0.5

A

-

p

LC3

0

0.0

I

p-AMPK

LC3II

AMPK

GAPDH

Quercetin

GAPDH

3-MA

-

-

25μmol/L

-

50μmol/L

-

25μmol/L

+

50μmol/L

+

Compound

Quercetin

C

-

-

25μmol/L

-

50μmol/L

-

25μmol/L

+

50μmol/L

+

groups.

1）F=79.79，P<0.001amonggroups；2）P<0.001betweenP<0.001between

圖4HL-60細胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的變化

groups.

1）F=48.84，P<0.001amonggroups；2）

圖5槲皮素對HL-60細胞內p-AMPK/AMPK表達的影響

Fig.4TheratioofLC3Ⅱ/ⅠinHL-60cellsFig.5QuercetinactivatedAMPKinHL-60cells

2.3

AMPK

槲

表達的變化

皮素處理后HL-60細胞中AMPK、p-

60

檢測蛋白表達。結果發現，

細胞24h，收集細胞，提取總蛋白，

槲皮素與

Western

Compound

blot

C

HL-60

不同濃度槲皮素

細胞24h后

（

，

25

Western

μmol/L

Blot

、50

檢

μmol/L

測細

）

胞

孵育

聯合用藥組與單用槲皮素組比較，p-AMPK的表

AMPK

達

析進行統計，

、p-AMPK

結果發現槲皮素能夠濃度依賴性的

蛋白的變化。采用兩因素方差分

中

AMPK

降低，CompoundC能夠阻斷槲皮素誘導

激活AMPK活性，使得AMPK的磷酸化水平增高

2.4

磷酸化（表3，圖5）。

的

對細胞凋亡及自噬的影響

CompoundC抑制AMPK磷酸化后槲皮素

（F=48.84，P=0.000）。25μmol/LCompoundC不同濃度槲皮素加或者不加CompoundC孵

與不同濃度槲皮素（25、50μmol/L）共同孵育HL-育HL-60細胞24h后，采用流式細胞儀Annex?

第4期

肖潔，等.槲皮素調控AMPK活性誘導HL-60細胞自噬與凋亡

inV-FITC+Pl

507

皮素濃度依賴性的誘導

染色法檢測凋亡細胞。結果顯示：

HL-60細胞凋亡的發生

槲L

低，

）組比較，

P<0.001

LC3Ⅱ/Ⅰ

。槲皮素

比值下降，

（50μmol/L

細胞自噬程度降

）+CompoundC

（

Compound

F=316.41，P=0.000）；槲皮素（（

μmol/L

25μmol/L

）組，

）組

P<

LC3

0.001

Ⅱ/Ⅰ

。抑制

比值

AMPK

低于槲皮素（50

組比較，細

C（

胞

25

凋

μmol/L

亡率下

）組與槲皮素

降（P<0.001

（

25

）

25

μmol/L

。

μmol/L

）

槲皮素

）

+

皮素誘導細胞自噬的作用減弱（表5，

的活性后，

圖7）。

槲

（50μmol/L）+CompoundC（25μmol/L）組與槲皮素

（

4

50

，圖

μmol/L

6）。

）比較，細胞凋亡率下降（P<0.001；表

表5AMPK磷酸化受抑后槲皮素對HL-60細胞自噬的

影響

Table5Theautophagylevelinducedbyquercetinafter

表4AMPK磷酸化受抑后槲皮素對HL-60細胞凋亡的

AMPKphosphorylationinhibited

影響

Table4Theapoptosislevelinducedbyquercetinafter

Quercetin/（μmol/L）

Compound

AMPKphosphorylationinhibited

Quercetin/（μmol/L）

Compound

25

Quercetin/

C

（

25

μmol/L

μmol/L

）

+

Quercetin

C25μmol/L+

LC3Ⅱ/Ⅰ4.20±0.346.47

50

±0.260.36±

25

0.16

1）

0.37±

50

0.22

2）

255025

（μmol/L）

n=3,1）P<0.001vssinglequercetin(25μmol/L)groups;2）P<

Apoptosis16.65±1.8528.35±1.235.47±0.66

1）

15.68

50

±1.25

2）

0.001vssinglequercetin(50μmol/L)groups.

n=6，1）P<0.001vssinglequercetin（25μmol/L）groups；

2）P<0.001vssinglequercetin（50μmol/L）groups.

3討論

不同濃度槲皮素加或者不加CompoundC孵

目前，聯合化療仍然是急性髓系白血病

育HL-60細胞24h后，蛋白免疫印跡法檢測細胞

（acutemyelocyticleukemia，AML）治療的主要方

中LC3Ⅱ/Ⅰ比值。結果顯示：槲皮素誘導HL-60

法。傳統的細胞毒性藥物治療急性白血病毒性

細胞自噬的作用與濃度相關，濃度越高，作用越

大，副反應多。槲皮素是植物來源的抗腫瘤藥物，

明

L）

顯

+Compound

（F=454.07

C（25

，P

μmol/L

=0.000

）組與槲皮素

）；槲皮素（

（

25

25

μmol/

μmol/

具有低毒性的特點，近年來受到廣泛的關注。有

研究發現槲皮素作為一種“分子靶向藥物”，可以

Quercetin25μmol/LQuercetin50μmol/L

40

1）P<0.001between2groups

1）

30

%

/

e

t

a

1）

r

s

Quercetin

i

s

o

t

20

+Compound

25

C

μmol/LQuercetin

+Compound

50

C

μmol/L

p

o

p

A

10

Quercetin

0

CompoundC

25μmol/L

-

25μmol/L

+

50μmol/L

-

50μmol/L

+

圖6AMPK磷酸化受抑后槲皮素對HL-60細胞凋亡的影響

Fig.6TheapoptosislevelinducedbyquercetinafterAMPKphosphorylationinhibited

508

中山大學學報（醫學版）第39卷

8

1）

1）

蛋白酶Caspa被激活，導致細胞凋亡的發生。研

究證實，槲皮素可以直接誘導白血病細胞發生線

u

a

6

粒體應激產生凋亡效應實現其抗白血病作用

［11］

。

/

o

i

t

a

r

最新的研究表明：自噬作為Ⅱ型細胞程序性死亡，

I

/

4

I

I

3

C

是腫瘤細胞的死亡方式之一

［12-13］

。在真核細胞

L

2

LC3

0

中，自噬通過溶酶體途徑降解損傷的細胞器及長

壽命蛋白等物質，對維持內環境穩定起到十分重

LC3

I

II

要的作用。在急性髓系白血病的研究中發現，硼

GAPDH

替佐米可以誘導急性髓細胞白血病發生自噬，通

過自噬途徑加速FLT-3/ITD的降解，繼而發揮其

Compound

Quercetin

C

25μmol/L

-

50μmol/L

-

25μmol/L

+

50μmol/L

+

抗白血病作用

［14］

。針對自噬途徑尋找新的治療靶

點是目前腫瘤研究的熱點。有研究表明：凋亡和

圖7

1）P

AMPK

<0.001

磷酸化受抑后槲皮素對

between2groups

HL-60細胞自噬的

自噬作為兩種不同的細胞程序性死亡，可能存在

影響

共同的信號分子通路。

Fig.7Theautophagylevelinducedbyquercetinafter

凋亡及自噬都受細胞內能量代謝的調控，腺

AMPKphosphorylationinhibited

苷酸活化蛋白激酶

干擾腫瘤細胞中信號轉導通路的關鍵靶點使細胞

AMPK

謝。AMPK

）是細胞的能量感受器，

（AMP-activated

由αβγ三個亞單位組成，

調節細胞能量代

proteinkina，

α-亞基N-末

死亡，對多種腫瘤細胞有生長抑制作用

［3-5］

。槲皮

端包含一個保守的

素可調節多種蛋白激酶如酪氨酸激酶、絲氨酸/蘇

氨酸激酶等，從而誘導細胞凋亡

［6-7］

。在美國，其

172

缺氧的狀態可能導致

）位點的磷酸化是其激酶活性所必需的。細胞

Ser/Thr激酶區，蘇氨酸（Thr-

AMPK的活化

［15］

。腫瘤常伴

作為非處方藥物（Difaprost

?

）用于前列腺癌的治

隨能量代謝紊亂和AMPK激活抑制。因此，AMPK

療；含有槲皮素的圓葉葡萄皮提取物治療生化復

被視為治療腫瘤的潛在作用靶點

［16］

。體內外研究

發前列腺癌的藥物臨床試驗正在進行中

［8］

。槲

發

皮素是一種有應用前景的抗腫瘤藥物。然而其

在急性髓系白血病中的研究非常有限，有文獻報

mTOR

現，激活急性髓細胞白血病AMPK并抑制

去磷酸從而產生抑制腫瘤的作用，

的活性，可使得翻譯起始因子

但對正常的髓

4E-BP1發生

道槲皮素能夠阻滯急性髓系白血病細胞于G0/G1

系造血干細胞功能無影響

［17］

。研究發現白藜蘆醇

期，誘導凋亡及保護性自噬的發生

［9］

，我們前期

能夠通過AMPK信號通路調節細胞內能量代謝，

研究發現槲皮素對急性髓系白血病HL-60細胞

抑制糖酵解，增加葡萄糖有氧氧化，增強腫瘤細胞

株有抑制增殖的活性

［3］

，但其具體的機制有待進

的氧化能力發揮抗腫瘤的作用

［18］

。本研究發現，

一步闡明。

槲皮素能夠活化HL-60細胞中AMPK，導致細胞

本研究發現，槲皮素能夠誘導白血病HL-60

內p-AMPK的表達增加。這一過程能夠被AMPK

細胞株發生凋亡，其對凋亡的影響呈時間及濃度

特異性的小分子抑制劑CompoundC所阻斷。但

依賴性。同時，通過電鏡、WesternBlot等檢測方

采用CompoundC阻斷AMPK的活化后，槲皮素對

法我們還發現，槲皮素能誘導HL-60細胞株發生

自噬。我們認為，槲皮素通過誘導HL-60細胞同

HL-60

素可能通過激活

細胞凋亡及自噬的誘導作用均減弱。槲皮

AMPK實現對HL-60細胞凋亡及

時發生凋亡和自噬，從而發揮其抗白血病作用。

自噬的調控。

但是其誘導凋亡及自噬的具體信號通路及信號分

綜上所述：槲皮素作為一種植物來源的低

子有待進一步明確。

毒性藥物，具有抗腫瘤的作用。槲皮素可能通

自噬與凋亡屬于兩種不同的細胞程序性死

過激活細胞內AMPK，影響細胞內能量代謝的變

亡。自噬、凋亡與腫瘤的發生、發展以及治療有著

化，導致細胞凋亡和自噬的發生從而發揮抗白

非常密切的關系

［10］

。細胞凋亡是受基因調控的精

血病作用。但其具體的分子通路還有待進一步

確過程，當細胞接受體內外信號刺激后，半胱氨酸

的闡明。

第4期

肖潔，等.槲皮素調控AMPK活性誘導HL-60細胞自噬與凋亡

509

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Prev

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127（7

au?

Anupdate

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induced

potently

toapoptosis

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histone

activates

H2B

stress-promotedtranscriptionvia

JNK-mediated

cellsto

cFLIP

TRAIL-

turnover

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（編輯孫慧蘭）