宇文皓月
——羥胺三氯化鐵法
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>
1. 掌握三氯化鐵比色法的實(shí)驗(yàn)原理、分析步調(diào)及酶測(cè)定的臨床意義。
2. 了解罕見(jiàn)全血膽堿酯酶活性測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)、注意事項(xiàng)。
3. 學(xué)會(huì)末梢血的收集。
實(shí)驗(yàn)原理
血液膽堿酯酶使乙酰膽堿分解為膽堿和乙酸。未被膽堿酯酶水解而剩余的乙酰膽堿和堿性羥胺反應(yīng)，形成紅色羌酸鐵絡(luò)合物。顏色深度與剩余乙酰膽堿的量成正比。在波長(zhǎng)520nm比色定量，由水解的乙酰膽堿的量計(jì)算膽堿酯酶活性。
試劑和資料
蒸餾水
鹽酸溶液(1＋2)
堿性羥胺溶液
磷酸鹽緩沖液(PH＝7.20)
三氯化鐵溶液
氯化乙酰膽堿尺度液
分光光度計(jì)
10mL比色管
漏斗
恒溫水浴箱，控溫±0.5℃
采血針頭
血色素吸管
采樣、運(yùn)輸和保管
用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸鹽緩沖液)，立即進(jìn)行測(cè)定。
實(shí)驗(yàn)步調(diào)
A 樣品管+0.98mL 磷酸鹽緩沖液+0.02mL全血 37℃水浴 5min
+1.0mL乙酰膽堿應(yīng)用液 37℃水浴 30min
B 對(duì)照管0.98mL磷酸鹽緩沖液+0.02mL全血 37℃水浴 5min
+1.0mL水 37℃水浴 30min
C 尺度管1.0mL 磷酸鹽緩沖液 37℃水浴 5min + 1.0mL乙酰膽堿應(yīng)用液37℃水浴 30min
D 空白管1.0mL 磷酸鹽緩沖液 37℃水浴 5min +1.0mL水
37℃水浴 30min
水浴之后對(duì)A、B、C、D四個(gè)試管分別進(jìn)行以下操縱：
1.加入 4.0mL 堿性羥胺溶液，充分振搖 2min；
2.加入 2.0mL 鹽酸溶液，充分振搖 2min；
3.加入 2.0mL 三氯化鐵溶液，充分振搖；
4.濾紙過(guò)濾，520nm比色。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
表1-1 520nm波長(zhǎng)下樣品的吸光度
樣品編號(hào) A B C D
吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000
結(jié)果計(jì)算
①計(jì)算酶活性的絕對(duì)值
帶入得： Xs==3.149μmol
Xs：水解乙酰膽堿的濃度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；
A：以試劑空白為參比的在波長(zhǎng)520nm處樣品管的吸光度值；
B：以試劑空白為參比的在波長(zhǎng)520nm處對(duì)照管的吸光度值；
C：以試劑空白為參比的在波長(zhǎng)520nm處尺度管的吸光度值。
②計(jì)算酶活性的相對(duì)值
Y==197
Y—酶活性的相對(duì)值，%；
Xs—被測(cè)血樣中酶活性的絕對(duì)值，μmol(0.02mL·37℃·30min)；
Xc—正凡人血中酶活性絕對(duì)值，μmol(0.02mL·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃·30min)
討論
1.由于未在網(wǎng)上查到北京市居民膽堿酯酶活性的參考尺度，遂以課件上浙江地區(qū)健康人膽堿酯酶活性絕對(duì)值作為參考。即：女：3.19 ± 0.398 μmol ；因3.149μmol在3.19 ± 0.398 μmol的區(qū)間內(nèi)，故該樣本的膽堿酯酶活性屬正常范圍。
2.各組所測(cè)數(shù)值偏差較大，可能與操縱差別如采血時(shí)間、振搖是否充分、加熱時(shí)間等導(dǎo)致膽堿酯酶活性變更有關(guān)。
3. 采血要迅速，防止凝固及氧化；振搖要充分，同時(shí)防止液體濺出；比色時(shí)有以D管調(diào)零。
注意事項(xiàng)
1.采血前應(yīng)準(zhǔn)備好試管，提前加入磷酸鹽緩沖液；
2.采血時(shí)嚴(yán)格消毒，用過(guò)的采血針?lè)湃肜魍仓校藓灧湃肜爸校怀苫旆牛?/span>
3.準(zhǔn)確控制水浴的溫度和時(shí)間，否則會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
4.加入三氯化鐵顯色后，20 min內(nèi)比色。
