實(shí)驗(yàn)四血清總膽固醇的測(cè)定（硫磷鐵法）
[目的要求]
掌握血清總膽固醇測(cè)定原理、方法及其臨床意義。
[臨床意義]
膽固醇是環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，主要來自體內(nèi)合成，一部分直接從食物中攝取。膽固醇在體內(nèi)不僅參與血漿脂蛋白的合成，而且可轉(zhuǎn)變?yōu)槟懼猁}、維生素D
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及某些類固醇激素(性激素、腎上皮質(zhì)激素等)。
血液中的膽固醇包括游離膽固醇及其酯兩種，二者總稱“總膽固醇”，其中膽固醇酯占70～75%。
糖尿病昏迷患者幾乎都有血清膽固醇濃度的增加。膽固醇增加還見于動(dòng)脈粥樣硬化、腎病綜合癥，總膽管阻塞及粘液性水腫。粘液性水腫膽固醇增加的主要原因是甲狀腺機(jī)能減退而垂體前葉有繼發(fā)性活動(dòng)過度所致。其它如肥大性骨關(guān)節(jié)炎、老年性白內(nèi)障、牛皮癬等，血清膽固醇濃度間或也有增加。
在惡性貧血、溶血性貧血以及甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)時(shí)，血清膽固醇含量降低。其它如嚴(yán)重肝病、感染、營養(yǎng)不良等情況，膽固醇總量常見降低。近年來大量文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)表明，血膽固醇含量過高與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，更引起了人們的注意。
[實(shí)驗(yàn)原理]
用無水乙醇提取血清中膽固醇同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)，向提取液中加入硫磷鐵顯色劑，膽固醇與濃硫酸及三價(jià)鐵作用，生成比較穩(wěn)定的紫紅色化合物，與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，求得其含量。
[標(biāo)本]
人或動(dòng)物血清。
[器材]
1．試管及試管架；
2．刻度吸量管或移液器；
3．離心機(jī)；
4．721型分光光度計(jì)。
[試劑]
1．膽固醇標(biāo)準(zhǔn)貯存液(1.0ml≈1.Omg)：精確稱取干燥重結(jié)晶膽固醇lOOmg，溶于無水乙醇內(nèi)(稍加溫助溶)，然后移入lOOml容量瓶中，加無水乙醇至刻度，貯于棕色瓶中，密塞瓶口置4℃冰箱內(nèi)保存。配制應(yīng)用液時(shí)，應(yīng)將其預(yù)先恢復(fù)至室溫。
2．膽固醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液(1ml≈0.05mg)：取上述貯存液5ml于100ml容量瓶中，加無水乙醇至刻度，再加蒸餾水2ml，貯于棕色瓶內(nèi)，置冰箱中保存，用時(shí)將其恢復(fù)至室溫。
3．鐵貯存液：稱取三氯化鐵(Fecl
3?6H
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O)2.5克溶于87％濃磷酸內(nèi)，并加至100ml，
貯于棕色瓶中．此液在室溫可長期保存。
4．顯色劑：取鐵貯存液8ml，加濃硫酸至100ml，此液在室溫可保存6～8周。
5．濃硫酸(AR)。
6. 無水乙醇(AR)。
[操作步驟]
1.無蛋白提取液的制備
準(zhǔn)確吸取血清0.10ml，置入干燥的小試管中，對(duì)準(zhǔn)血清吹入無水乙醇2.9ml，使蛋白質(zhì)分散成細(xì)小的沉淀，用力振蕩約10s，放置5min，再次搖勻沉淀，置2000r／min離心約10min。
2．顯色取干燥試管三支，分別標(biāo)記，按下表操作：
3. 測(cè)定
顯色劑加畢，立即振搖15～20次，置室溫下冷卻15min，然后用550nm波長以空白調(diào)零點(diǎn)，測(cè)出各管吸光度。
[計(jì)算]
血清總膽固醇(mg／d1)× 0.02586(或除以38.67)＝ mmol／L
[正常值]
2.9～6.Ommol／L(110～230mg／d1)。
[注意事項(xiàng)]
(1)離心后上清液必須清亮透明，不能混有細(xì)微沉淀顆粒，否則要重新離心。
(2)顏色反應(yīng)與加顯色劑后混合時(shí)的產(chǎn)熱程度有關(guān)，因此操作中應(yīng)注意：①加入顯色劑必須與乙醇分成
兩層，可后混合，不能邊加邊搖，否則顯色不完全；②顯色劑要加—管混和一管，混合的手法也要一致；③混合時(shí)試管發(fā)熱，注意勿使管內(nèi)液體濺出，以免損傷衣服、皮膚、眼睛。
[思考題]
1. 本實(shí)驗(yàn)操作中特別需要注意些什么？為什么？
2. 酯類難溶于水，將它們均勻分散在水中則形成乳濁液，為什么正常人血漿和血清中含有酯類雖多，但卻清澈透明？
