（整理）b型流感嗜血桿菌結合疫苗
b型流感嗜血桿菌結合疫苗
b Xing Liuganshixueganjun Jiehe Yimiao
Haemophilus Influenzae Type b Conjugate Vaccine
本品系用純化的b型流感嗜血桿菌(Hib)莢膜多糖（Capsular polysaccharide，CPS）抗原，通過己二酰肼（ADH）與破傷風類毒素（Tetanus toxoid，TT）蛋白共價結合制成。用于預防b型流感嗜血桿菌引起兒童的感染性疾病，如腦膜炎、肺炎等。
1 基本要求
生產和檢定用設施、原料及輔料、水、器具、動物等應符合“凡例”的有關要求。
2 制造
2.1 菌種
生產用菌種應符合“生物制品生產檢定用菌毒種管理規程”的有關規定。
2.1.1 菌種名稱及來源
采用b型流感嗜血桿菌CMCC58547或CMCC58534菌株，來源于中國藥品生物制品檢定所。
2.1.2 種子批的建立
應符合“生物制品生產檢定用菌毒種管理規程”的規定。
2.1.3 種子批的傳代
主種子批啟開后傳代次數不超過5代，工作種子批啟開后至接種發酵罐培養傳代次數不得超過5代。
2.1.4 種子批菌種的檢定
檢定菌種可用含羊血的巧克力培養基或Hib綜合培養基。
2.1.4.1培養特性
b型流感嗜血桿菌菌種在普通營養瓊脂培養基上不生長，在含羊血的巧克力培養基或在Hib綜合瓊脂培養基上生長，生長需要X因子（氯化血紅素）、V因子（β輔酶A）；衛星試驗陽性，菌落形狀灰白色、半透明、光滑凸起，濕潤，邊緣規則。
2.1.4.2染色鏡檢
應為革蘭氏陰性短小桿菌、有莢膜，有時連成線狀，亦可有單個陰性球菌。
2.1.4.3 生化反應
發酵葡萄糖、木糖、半乳糖，產酸不產氣。不發酵蔗糖、乳糖和果糖。賴氨酸脫羧酶反應呈陰性。
2.1.4.4血清學試驗
將在35～37℃培養的菌苔，與Hib免疫血清進行玻片凝集試驗，應有強凝集反應。
2.1.5 種子批的保存
種子批應凍干后保存于8℃以下。
2.2 原液
2.2.1 生產用種子
啟開工作種子批菌種，接種在液體或固體Hib綜合培養基上，制備數量適宜的生產用種子。
2.2.2生產用培養基
采用Hib綜合培養基。不得含有對人體有害或其他過敏原物質。
2.2.3培養
采用培養罐液體培養，在培養過程中取樣進行純菌試驗、涂片革蘭氏染色鏡檢，如發現污染雜菌，應廢棄。
2.2.4收獲及殺菌
于對數生長的后期或靜止期的前期終止培養，取樣進行菌液濃度測定及純菌檢查，然后于
培養物中加入適宜濃度的甲醛溶液或脫氧膽酸鈉溶液殺菌，以確保殺菌完全及不損傷Hib 莢膜多糖為宜。
2.2.5 多糖提取和純化
2.2.5.1將已殺菌的培養物，離心去菌體后收集上清液，采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）沉淀收集復合多糖，乙醇沉淀收集粗制多糖，或超濾濃縮后乙醇沉淀，取上清，然后加入適宜濃度的乙醇溶液沉淀多糖，并依次用無水乙醇、丙酮洗滌沉淀物，干燥后即為粗制多糖，-20℃或以下保存。
將粗制多糖溶解于1/10飽和醋酸鈉溶液中，然后按適當比例用冷酚溶液重復抽提數次。收集上清液，并透析或超濾脫酚，再加乙醇至最終濃度為60%-80%，離心后收集沉淀物，或超濾濃縮后乙醇沉淀，取上清，然后加入60%-80%的乙醇溶液沉淀多糖，依次用無水乙醇、丙酮于離心洗滌，真空干燥，所得固體即為精制多糖。
2.2.5.2 多糖檢定
按3.1項進行。
2.2.5.3 保存及有效期
保存于 -20℃或以下，保存時間按批準的執行。
2.2.6多糖衍生
2.2.6.1將精制多糖溶解后，按適宜比例加入溴化氰進行活化，然后向反應液中加入適宜濃度的己二酰肼溶液，反應過夜。再將反應液超濾或透析?？蓛龈墒占腆w衍生物。
2.2.6.2 多糖衍生物檢定
按3.2項檢定。
2.2.6.3 保存及有效期
保存于－20℃或以下，保存時間不超過30天。
2.2.7 載體蛋白
載體蛋白為破傷風類毒素。破傷風類毒素原液制造和檢定應符合“吸附破傷風疫苗”
2.1-2.2項規定。
可采用柱色譜或其他經批準的方法對破傷風類毒素原液進一步純化，并配制至適宜濃度。
2.2.8 多糖蛋白結合物的制備
2.2.8.1結合
多糖衍生物與破傷風類毒素蛋白等量混合，加入碳二亞胺(EDAC)進行反應。然后透析或超濾透析。
2.2.8.2結合物純化
結合物用柱色譜純化,收集Vo附近的洗脫液，合并各次層析收獲的洗脫液即為純化的結合物，除菌過濾后,即為結合物原液。
2.2.9 原液檢定
按3.3項檢定。
2.2.10 保存及有效期
保存于2～8℃，保存時間不超過6個月。
2.3 半成品
2.3.1 配制
用氯化鈉注射液稀釋多糖結合物原液，每1毫升疫苗溶液含Hib莢膜多糖應不低于20μg。
2.3.2 半成品檢定
按3.4項進行。
2.4 成品
2.4.1 分批
應符合“生物制品分批規程”規定。
2.4.2 分裝
應符合“生物制品分裝和凍干規程”規定。
2.4.3 規格
每瓶0.5ml，每1次人用劑量0.5ml，含純化b型流感嗜血桿菌莢膜多糖10μg。
2.4.4 包裝
應符合“生物制品包裝規程”規定。
3 檢定
3.1 多糖檢定
3.1.1 鑒別試驗
采用免疫雙擴散法（附錄VIII Ｃ），應與b型流感嗜血桿菌免疫血清形成明顯沉淀線。
3.1.2 化學檢定
3.1.2.1 固體總量
依法測定（附錄VII M）。
3.1.2.2 核糖含量
以D-核糖為對照，應為320-410mg/g（附錄XXXX）。
3.1.2.3 磷含量
應為68-90mg/g （附錄VII A ）。
3.1.2.4 蛋白質含量
應小于10mg/g（附錄VI B 第二法）。
3.1.2.5 核酸含量
應小于10 mg/g，核酸在波長260nm處的吸收系數(E1%1cm)為200 （附錄II A）。
3.1.2.6 多糖分子大小測定
采用Sepharo CL-4B凝膠柱（1.6×100cm）測定， K D≤0.5的多糖回收率應不低于50%。（附錄XXX）。
3.1.3 細菌內毒素檢查
應不高于25EU/μg（附錄XII E）。
3.2 多糖衍生物檢定
3.2.1 己二酰肼含量
應為16–45μg/mg（附錄XXXX）。
3.2.2 殘余氰化物含量
應不高于10ng/mg（附錄XXXX）。
3.3 結合物原液檢定
3.3.1 鑒別試驗
采用免疫雙擴散法（附錄VIII Ｃ），應與b型流感嗜血桿菌免疫血清及破傷風類毒素免疫血清形成明顯沉淀線。
3.3.2 化學檢定
3.3.2.1多糖含量
以D-核糖為對照，按核糖含量計算結合物中多糖含量，應不低于28μg/ml（附錄XXXX）。
3.3.2.2 蛋白質含量
應不低于48μg/ml（附錄VI B 第二法）。
3.3.2.3 多糖與蛋白質的比值
按3.3.2.1和3.3.2.2測定結果計算，應為0.30-0.59。
3.3.2.4 高分子結合物含量
高分子結合物應為80%-100%或游離多糖≤20%（附錄XXXX）。
3.3.2.5 分子大小測定
采用Sepharo CL-4B凝膠柱（1.6×100cm）測定，K D值應不高于0.20， K D值小于0.20的洗脫液回收率應不低于60%。（附錄VIII G）
3.3.2.6 EDAC殘留量
采用N.wilchek方法測定，EDAC殘留量應低于10μmol/L（附錄XXXX）。
3.3.3 無菌檢查
依法檢查（附錄XII A），應符合規定。
3.3.4 細菌內毒素檢查
應不高于5EU/μg（附錄XII E）。
3.4 半成品檢定
無菌試驗
依法檢查（附錄XII A），應符合規定。
3.5 成品檢定
3.5.1 鑒別試驗
采用免疫雙擴散法（附錄VIII Ｃ），應與b型流感嗜血桿菌免疫血清及破傷風類毒素免疫血清形成明顯沉淀線。
3.5.2 物理檢查
3.5.2.1 外觀檢查
應為無色透明液體，無異物。
3.5.2.2 裝量
按附錄ＩＡ中裝量項進行檢查，應不低于標示量。
3.5.3 化學檢定
3.5.3.1 pH值
應為5.0～7.0（附錄V A）。
