基于分子學學角度探討無尾目分類

2024年2月20日發(作者：輔導員培訓心得)

XXXX大學

作業題目： 線粒體基因探討無尾目的分類研究進展

課程名稱： 動物分類學

任課教師姓名： XXXXX

研究生姓名： XXXXX

學 號： XXXXXXXX

年 級： 2010級

專 業： 動 物 學

學院（部、所）： 生命科學學院

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年 月 日

線粒體基因探討無尾目的分類研究進展

摘 要：運用PCR技術和相關生物軟件，對大頭蛙Limnonectes kuhlii和脆皮大頭蛙Limnonectes fragilis的線粒體CO I基因全序列進行了測定與分析．結合GenBank上已公布的無尾目1O個科22個物種的同源序列，以爬行綱楔齒蜥Spkenodon punctatus和密河鱷Alligator m ss厶s 如，2s厶為外群，基于核苷酸序列(選取前兩位密碼子)和氨基酸序列兩種數據形式，分別構建NJ樹和MP樹．結果表明：系統樹將無尾目1O個科分為兩大支，一支為新蛙亞目Neobatrachia的5科15個物種，一支為古蛙亞目Archaeobatrachia的5個科9個物種(其中包括鋤足蟾科Pelobatidae和負子蟾科Pipidae)，并推測這兩個亞目均為單系群．古蛙亞目一支內的盤舌蟾科Discoglossidae與鈴蟾科Bombinatoridae親緣關系較近；新蛙亞目內蟾蜍科Bufonidae與雨蛙科Hylidae，蛙科Ranidae與樹蛙科Rhacophoridae兩兩親緣關系較近．蛙科中澤陸蛙Fejervarya limnocharis與大頭蛙屬3個種首先形成姐妹群，表明其較近的親緣關系，同時推斷大頭蛙與福建大頭蛙Limnonectes fujianensis親緣關系近于脆皮大頭蛙．

關 鍵詞：大頭蛙；脆皮大頭蛙；CO I基因；無尾目；系統關系

目前，兩棲動物的分類和保護工作一直是國際野生動物保護的熱點。由于人們對兩棲類資源的過度利用和捕殺，加之生境破壞，棲息地減少，造成野外種群數量逐漸減少，尤其是兩棲類無尾目動物的保護現狀更加嚴峻，例如：棘胸蛙已被列入瀕危動物紅皮書，而虎紋蛙在野外多年沒有報道。

1.無尾目的分類進展

現存兩棲動物(Lissamphibians)分為形態迥異的3個目，即無尾目(Anura)、有尾目(Caudata)和蚓螈目(Gymnophiona)．無尾目是其中最大的一個目(占88 左右)，已知現有29個科5 449個物種，廣泛分布于全球(到2007年6月17日為止，分布于中國的330多種兩棲動物中有無尾目290種左右，隸屬7個科 ]．Reig 最初依據形態學特征將無尾目分為始蛙亞目(Archaeobatrachia)和新蛙亞目(Neobatrachia)兩大類(或稱古蛙類和新蛙類)．此后Laurent 將鋤足蟾科(Pelobatidae)、負子蟾科(Pipidae)、異舌蟾科(Rhinophrynidae)和潛蟾科(Pelodytidae)從始蛙亞目中的分離出來建立了一個過渡類群—— 中蛙亞目(Mesobatrachia)．通過進一步的形態學研究，1993年Ford和Cannatella 將新蛙亞目和中蛙亞目作為姐妹群而一起歸為Pipanura，并否定了始蛙亞目(包括，尾蟾科Ascaphidae，滑踱蟾科Leiopel—matidae，鈴蟾科Bombinatoridae和盤舌蟾科(Disco—glossidae)這一單系類群．20世紀90年代以后，分子系統學研究成為動物進化研究的熱點之一，在無尾目內不同譜系間系統發生關系的問題上，國內

外學者進行了大量的研究，然而，對于無尾目各科間的系統關系至今還沒有統一的意見．能快速進化并呈母系遺傳的線粒體DNA，是無尾目動物分類和保護工作中經常利用的分子信息。在大多數脊椎動物中，線粒體DNA在進化上十分保守，多數物種均含有37個基因，包括編碼12SrRNA、16SrRNA 2個RNA的編碼基因；細胞色素c氧化酶亞單位基因CO1、COIl、COlll、ATP酶亞單位6、8和細胞色素b的基因及7個呼吸鏈NADH脫氫酶亞單位基因ND1、ND2，ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6等13個蛋白質編碼基因，以及22個為tRNA基因，這些基因的排列順序在脊椎動物中是十分保守的。但是在無尾目動物中，由于線粒體基因組的演化速度較其它動物快，所以常發生基因重排現象；尤其在高等的新蛙亞目中，目前的研究表明，線粒體基因的重新排列是一種很常見的現象。無尾目動物線粒體基因組結構研究現狀自從2001年Sumida等分析了黑斑蛙(Rana nigromaculata)的線粒體全序列，并首次發現D—loop區附近有四個tRNA發生了交換與重排以來，越來越多的不同于典型的脊椎動物的線粒體結構在無尾目動物中被發現。2004年Sano等分析了樹蛙科卡吉卡蛙的線粒體全序列，結果表明D—loop區附近的四種tRNA基因發生重合，形成ND5tRNALel/tRNAThr／tRNAPm，tRNAPhe／l 2S的基因簇，除此之外，還發現其基因組中蛋白質編碼基因ND5發生了移位圈。2005年Liu Z Q等分析了澤蛙的線粒體基因排列，發現一種新的脊椎動物線粒體排列方式。D—loop區附近的幾種tRNA基因重排,形成ND5，tRNAThr／tRNAPro／tRNALeu／tRNAPhe／1 2S的基因簇，并且多了一個拷貝的tRNAMet，蛋白質編碼基因ND5也發生移位，并且分析了ND5的重排以及這些基因重排的可能機制。2005年Zhang P等分析了樹蛙科的斑腿泛樹蛙的線粒體全序列，發現兩棲動物中的一種新的基因排列方式，D—loop區附近的四種tRNA基因發生重排，形成tRNAThr／tRNALeu(CUN)／tRNAPro／tRNAPhe的基因簇。更特別的是ATP8被一段853bp的非編碼區所取代，因而失去其作為蛋白質編碼基因的功能，ND5徹底缺失。2006Kurabayashi等研究了曼蛙科馬達加斯加彩蛙的線粒體全序列，并應用于高等蛙科動物的系統進化分析罔。曼蛙科馬達加斯加彩蛙的基因組結構十分復雜：五種tRNA基因(tRNAIle／tRNAMet／tRNALeu(CUN)／tRNAPro／tRNAPhe)串聯在一起形成基因簇，位于ND5和12S

rRNA之間；tRNAThr轉移到tRNALeu(UUR)和ND1中間；ND5移位到CR1的下游；基因組中多了一段控制區以及一個tRNAMet的拷貝。這種現象可用“倍增一隨機刪除”模型進行解釋。2007年SuX等研究了凹耳蛙的線粒體全序列，并應用于無尾目動物的系統進化分析。凹耳蛙不同于其他的蛙科動物，tRNAHis從ND4后移位到D—loop區后，形成一種新的線粒體基因排列方式。截止2009年1月，在GenBank上已公布的無尾目動物線粒體全序列有24個物種(表1)，涉及到無尾目兩大亞目中l0個科。分別為鈴蟾科(Bombinatoridae)4種，盤舌蟾科(Discoglossidae)2種， 負

子科(Pipidae)2種， 鋤足蟾科(Pelobatidae)1種，蟾蜍科(Bufonidae)2種，雨蛙科(Hylidae)1種，蛙科(Ranidae)5種，樹蛙科(Rhacophoridae)3種，姬蛙科(Microhylidae)3種，曼蛙科(Mantellinae)1種。對這些無尾目動物的線粒體基因組進行分析， 可見基因組中最短的是黑眶蟾(Bufomelanosfictus(16328bp)，最長的是馬達加斯加彩蛙(Mm Jtella madagascariensis)(22874bp)，其余多數都在16—17 kb之問。大部分物種的線粒體基因組包含13個蛋白質編碼基因、2個rRNA基因、22個tRNA基因和控制區。

2.無尾目動物線粒體基因組結構改變的規律

根據前人對無尾目動物線粒體結構的研究成果進行分析， 可以發現：在始蛙亞目(Archaeobatrachia)中，線粒體基因組具有和典型脊椎動物相同的排列方式，很少發生重排。已測序的東方鈴蟾、紅服鈴蟾、dplc、多彩鈴蟾、盤舌蟾、產婆蟾、強刃鋤足蟾、非洲爪蟾和非洲蛙的線粒體基因組都沒有發生明顯重排。但在高等的新蛙亞目(Neobatrachia)中，線粒體基因組的結構常常由于基因重排而發生改變。這種改變主要表現

在三個方面：

2．1 tRNA基因的改變在新蛙亞目中，tRNA基因常發生添加現象，比如，澤蛙具有多余的一個tRNAMet的拷貝，馬達加斯加彩蛙更是多了兩個tRNAMet的拷貝。而tRNA基因的缺失夜常有發生，例如：黑眶蟾蜍中tRNALeu(GUN)，tRNAThr,tRNAPro三個tRNA基因都發生了缺失。更多的情況下tRNA基因會發生移位現象，特別是D—loop區附近的幾個tRNA常發生了交換與重排，黑斑蛙、小弧斑姬蛙、花狹口蛙、中國雨蛙、澤蛙、卡吉卡蛙、斑腿泛樹蛙、馬達加斯加彩蛙等都發生了不同類型的重排。

2．2蛋白質編碼基因的改變在新蛙亞目中，蛋白質編碼基因也常發生改變，尤其是蛋白質ND5編碼基因的移位或缺失尤為明顯，澤蛙、卡吉卡蛙、馬達加斯加彩蛙等的ND5編碼基因都發生移位，史立積綠樹蛙ND5徹底缺失，ATP8被一段85360的非編碼區所取代，因而失去其作為蛋白質編碼基因的功能。

2．3非編碼區被分割開， 出現兩個D-loop區，史立積綠樹蛙和馬達加斯加彩蛙mtDNA中存在兩段D-loop區的現象。通過對目前的無尾目線粒體DNA的分析，發現無尾目線粒體具有8種排列方式(A，B，c，D，E，F，G，H)。根據重排的方式不同，我們將這8種排列方式歸納為三大類，第一大類：始鮭亞目具有的典型的排列方式，第二大類：新蛙目具有典型的排布方式和變種，第三大類：桐蛙科和蔓蛙科的獨特揮列方式。

第一類是始蛙亞目具有的典型的排列方式(A)，這種排列方式和已知的典型的脊椎動物典型的線粒體排列方式一致。已測出的始蛙亞目的東方鈴蟾(Bombina

orientalis)、紅服鈴蟾(Bombina bombina)、 盤舌蟾(Discoglossusgal ganoi)、多彩鈴蟾(Bombina variegata)、產婆蟾(Alytes obstetricans pertinax)、強刃鋤足蟾(Pelobates cuhripes)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、非洲蛙(Xenopus

tropicalis)線粒體排列方式都是這種類型。第二類是新蛙亞目較為常見的排列方式及這種排列方式的變化形式，大部分新蛙亞目的線粒體排列順序都是這種重排(B)，包括：金線蛙(Rana plancyi)、小弧斑姬(Microhyla heymonsi)、花狹口蛙(Kaloula pulchra)、飾紋姬蛙(Microhyla omata)、中國雨蛙(Hyla

chinensis)、黑斑蛙(Rana nigromaculata)、中華大蟾蜍(Bufo gargarizans)等。這種排列方式是其他兩種排列方式(C，E) 的基礎。黑眶蟾蜍(Bufomelanostictus)是一種較為特殊的類型(C)，它和(B)比較可以發現其丟失了三個tRNA基因。如果(B)的排列方式中tRNAHis發生移位，就產生凹耳蛙(Amolops tormotus)的排列方式(E)。在這一類型中，排列(B)是最常見也是最基礎的一種類型，通過對這一重排現象的研究有助于研究新蛙亞目物種的進化關系。第三類就是樹蛙科和曼蛙科的線粒體排布，其順序更為復雜。目前公布的3種樹蛙科的線粒體排布順序各不相同，各自代表一種排列方式(D、F、H)。卡吉卡蛙(Buergeria buerg)的為(D)，它的ND5發生了重排；史立積綠樹蛙(Rhacophorus schlegelii)為(F)，斑腿泛樹蛙(Polypedates megacephalus)的ND5和ATP8缺失成為(H)型。除了三種樹蛙外，曼蛙科(有時也作為一個亞科列入樹蛙科)的馬達加斯加彩蛙(Mantella madagascariensis)發生了大量的重排，它的線粒體排布順序為(G)，這一類的排列方式是重排涉及基因最多，重排順序最復雜的一類。樹蛙科的這種復雜的排列方式的變異說明樹蛙科可能是新蛙亞目中進化上較為高級的一科。TDRL模型，是解釋基因重排的最常用也是最重要的一種模型。根據TDRL模型，一般認為發生變化的基因順序的產生是來自于對原來正常的序列在串聯復制或倍增后進行了多余拷貝的隨機刪除，而原來位置上的基因或者保留或者改變，這樣就形成了新的基因排列方式。進一步研究表明這種基因的串聯復制或倍增并不是隨機的，它有一種位置效應，多分布在兩個復制起始位點附近，并伴隨控制區的倍增或分割。由于這種位置效應，新的基因排列方式造成的無尾目動物的線粒體基因組的結構改變也就可能具有規律性。例如Kumazawa的研究認為，爬行動物線粒體基因組中的tRNA基因重排大多集中在HSL、WANCY、和IQM區線粒體基因組結構研究展望脊椎動物線粒體基因結構一般比較穩定，重排相對較少發生，但是當重排出現時，能夠很好的鑒別單系群。這是因為同樣的基因順序不可能是通過不同的變異而獨立地產生， 同樣的基因順序往往說明有共同的祖先，因此具有共同的基因排列順序很可能表明有共同的祖先 。線粒體基因的排布可為評估脊椎動物系統發生關系提供重要信息，尤其較高分類階元間

的系統發生關系上，基因排列的比較將是解決具有爭議的系統發生關系的有力工具，在分析生物系統發生關系上通常被認為是一個很有價值的分子標記，這對于無尾目動物的系統進化分析具有重要的意義。基于核苷酸(P1，2)和氨基酸的序列數據分別構建出了無尾目動物1O個科24種的NJ樹和MP樹，兩種系統樹顯示出很高的相似性．它們均將24個物種分成兩大支，一支為蛙科6種、樹蛙科4個物種、姬蛙科和蟾蜍科各2個物種及雨蛙科1個物種(屬于新蛙類)；而鈴蟾科3個物種、負子蟾科和盤舌蟾科各兩個物種及尾蟾科和鋤足蟾科各一個物種構成了第二大支(屬于古蛙類)，推斷兩者均為單系群．蛙科、樹蛙科10個物種與姬蛙科2個物種首先形成姐妹群后，再與雨蛙科、蟾蜍科3物種形成一大支，且均具有較高的支持值(自檢值≥75 )．鈴蟾科3物種、負子蟾科2物種間以較高支持值各自聚為一支，鋤足蟾科的強刃鋤足蟾Pelo—bates cultripes位于第二大支的基部．在第二大支中，NJ樹結果(圖3)顯示：鈴蟾科3物種一支與盤舌蟾科2物種一支形成姐妹群，表明兩者具有較近的親緣關系．而MP樹顯示：尾蟾科、鈴蟾科和盤舌蟾科6物種先聚為一支，再與負子蟾科物種形成姐妹群．對6種蛙科動物而言，大頭蛙屬3個物種與澤陸蛙的親緣關系表現為：與脆皮大頭蛙相比，大頭蛙與福建大頭蛙親緣關系更近，澤陸蛙再與三者的形成姐妹群．此外，系統樹還表明，同屬于林蛙屬(Rana)的金線蛙與黑斑蛙具有很近的親緣關系．作為線粒體中度保守的蛋白質編碼基因，無尾目24個物種的CO I基因的3個不同編碼位置堿基含量變化表現出一定的規律性，從圖1的標準差可以看出，第3位點各堿基含量變化最大，而第2位點堿基組成較為“穩定”．另一方面，堿基替換頻率同樣表現出第2位點最為保守(8：10，R一0．9)，而密碼子第3位點承擔較小的進化壓力，其替換頻率明顯高于前兩位點，轉換／顛換為146：131(R一1．2)．Knight和Mindell 認為在重建系統樹時，轉換與顛換的比值若小于2．0，此基因序列突變已達到飽和狀態，受進化噪音的影響可能性較大，重建系統發生時如不進行特別加權就會出現錯誤信息．本研究中無尾目物種線粒體CO I基因R值約為1．2，第3位點的轉換數趨于飽和，對于這種現象一些學者建議去除第3位密碼子(或加權分析) ．因此，本研究在構建NJ樹時只選擇了3位密碼子的前兩位(P1，2)數據進行分析處理．

3 討論

無尾目內亞目及科間系統關系一直存在爭議，焦點主要集中于古蛙亞目(或古蛙亞目和中蛙亞目)各科間系統發生關系，即其為單系還是并系(Monophyly or

Paraphyly)問題．1986年Duellman和Truebn 依據形態學數據支持古蛙亞目為并系群，此后一些學者運用分子系統學方法也支持這一觀點 ．而另一些分子方面的研究均支持1975年Duellman。。將古蛙亞目(這里包含中蛙亞目)視為單系群的觀點 ．基于線粒體CO I基因的兩種序列數據形式，文分別運用兩種不同方法(NJ

與MP法)構建出的系統樹均將無尾目10個科分成兩大支—— 古蛙亞目和新蛙亞目(各支支持值均大于75 )，其中古蛙亞目包括了Laurent 認為隸屬中蛙亞目的鋤足蟾科和負子蟾科，這與Hay等 基于線粒體基因構建無尾目22個科的NJ樹結果一致．在古蛙亞目中，鈴蟾科原為盤舌蟾科中的鈴蟾屬，1993年Ford和Cannatella將它提升為鈴蟾科，目前有不少分類學家將它們仍視為一個科—— 盤舌蟾科．本研究中構建的2種系統樹均顯示盤舌蟾科和鈴蟾科為姐妹群關系(雖然白檢值不高)，這表明了兩者親緣關系較近，該觀點在最近的一些研究中同樣被證實了．系統樹同時顯示鋤足蟾科的強刃鋤足蟾P．cultripes位于古蛙亞目一大支的最基部，這一結論在早期的線粒體rRNA 基因的研究。 Hay等 將新蛙亞目分為3個主要支系，分別為Bufonoidea(蟾蜍總科)E2o]、Ranoidea(蛙總科)和一個獨立的Sooglossidae(塞舌蛙科)．依據此，本文中的雨蛙科(Hylidae)和蟾蜍科(Bufonidae)歸屬于Bufonoidea中，而姬蛙科(Microhylidae)、蛙科(Ranidae)和樹蛙科(Rhacophoridae)歸屬于Ranoidea中．中國學者費梁等 根據椎體不同類型將無尾目分為4大類(后凹型亞目Opisthocoela、變凹型亞目Anomoeoela、前凹型亞目Procoela和參差型亞目Diplasiocoela)，因此，本研究中的蟾蜍科和雨蛙科歸屬于前凹型亞目，而蛙科、樹蛙科和姬蛙科歸屬于參差型亞目．本文2種系統樹將新蛙亞目分為兩支，一支為蛙科、樹蛙科和姬蛙科12個物種，另一支為蟾蜍科和雨蛙科3個物種，這與上述傳統分類觀點一致．在第一支中，樹蛙科與蛙科首先形成一小支，再與姬蛙科形成姐妹群，表明樹蛙科與蛙科親緣關系較近，并推測在進化過程中，姬蛙科動物可能是首先從該群祖先物種中分化出來的一支．此外，從系統樹可以看出，蛙科內大頭蛙屬Limnnonectes與陸蛙屬FeJervarya親緣關系較近，而大頭蛙屬3個種間，福建大頭蛙與大頭蛙的親緣關系近于脆皮大頭蛙，這與先前的研究結果一致。當然，本文基于線粒體CO I基因全序列構建的兩種分子系統樹也存在細微的差異，且部分科間或物種間的白檢支持值較低，這給本文推演部分科間系統關系帶來了一定的干擾．要更科學、準確地推演出無尾目各科間的系統發生關系，可能需要增加更多“有效的”分子信息，選擇更多代表物種和不同的聚類方法(如：ML和Bayesian法)，結合形態學和細胞生物學等相關數據綜合考慮才能實現．

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