硫酸銨分級沉淀法分離純化酵母蔗糖酶實驗報告

2024年3月15日發(作者：手工制作風箏)

硫酸銨分級沉淀法分離純化酵母蔗糖酶實驗報告

實驗方法原理：

當高濃度鹽存在時，蛋白質往往凝聚并析出沉淀。稱為鹽析。

不同的蛋白質在不同濃度的鹽中形成沉淀，所以鹽析常用于蛋白質

的分離純化。幾種因素如pH、溫度、蛋白質純度在測定各種蛋白質

的鹽析時起著重要作用。

選擇硫酸銨是因為它具有一些優良性質，如鹽析的有效性、pH

范圍廣、溶解度高、溶液散熱少和經濟適用。

實驗材料：

蛋白質溶液、試劑、試劑盒、硫酸銨、用于懸浮沉淀物的緩沖

液、儀器、燒杯、磁力攪拌器和攪拌子、離心機和轉頭。

實驗步驟：

1.將盛有蛋白質溶液的燒杯放在裝另一裝有冰水的大燒杯內，

并置于磁力攪拌器上攪拌；

2.邊攪拌，邊徐徐加入56.8g硫酸銨至飽和，該步驟應在5或

10min內完成；

3.繼續攪拌10～30min；

4.10000g離心10min或3000g30min；

5.棄去上清液。將沉淀懸浮于1或2倍沉淀物體積的緩沖液

中，殘留的不溶性物質可能是變性蛋白，通過離心除去；

6.硫酸銨能夠通過透析，超濾或脫鹽柱除去。

注意事項：

1.攪拌必須是有規則的和溫和的。攪拌太快將引起蛋白質變

性，其變性特征是起泡。用磁力攪拌器不明顯產熱，這一點也很重

要。

2.大多數蛋白質在鹽溶解后的前20min沉淀，一些蛋白質要經

數小時才能完全沉淀。

3.為了平衡硫酸銨溶解時產生的輕微酸化作用，沉淀反應至少

應在50mm/L緩沖液中進行。

4.緩沖液應含有合劑以除去硫酸銨中微量的重金屬離子，因為

這些離子對目的蛋白質是有害的。

5.為確保獲得最大量沉淀，使用蛋白質初始濃度至少為

1mg/ml。

6.硫酸銨沉淀反應通常是貯存和穩定蛋白質的良好方法。

7.少數蛋白質在硫酸銨濃度低于24％時就產生沉淀，而大多數

要在80％以上才能沉淀。在純化的初始階段，常利用蛋白質在硫酸

銨中溶解度的差異分離蛋白質。硫酸銨沉淀可除去RNA和DNA。

8.在蛋白質的等電點其溶解度降低，在此條件下，靜電的相互

作用可導致蛋白質凝聚和沉淀在蛋白質的等電點，低濃度的硫酸銨

就能沉淀蛋白質。

9.在蛋白質結晶實驗中，采用硫酸銨沉淀十分有效。