中國科學論文模板中文

2024年2月9日發(作者：1月英文縮寫)

submit stencil

《中國科學》雜志社

SCIENCE IN CHINA PRESS

基于固定化納米金增強化學發光雙酶傳感器測定葡萄糖

林潔華, 張慧, 張書圣*

青島科技大學化學與分子工程學院; 生態化工教育部重點實驗室, 青島 266042

* 聯系人,E-mail:******************收稿日期：2008-09-12; 接受日期：2008-10-15

山東省自然科學基金 (批準號: Q2007B03)、青島科技大學博士基金 (批準號: 0022141)和國家自然科學基金(批準號: 20775038)資助

摘要 研制了一種新型流動注射化學發光(CL)雙酶傳感器, 用于葡萄糖的檢

測. 該傳感器將摻雜金納米粒子(GNPs)的殼聚糖膜包覆在硅烷化試劑預處理的玻璃微珠上, 用于吸附固定葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根過氧化物酶(HRP). 葡萄糖在GOD的催化下發生氧化反應生成H2O2, 生成的H2O2在HRP的催化作用下與魯米諾發生反應, 并產生化學發光信號. 實驗表明, 殼聚糖中摻雜的GNPs不僅能夠有效的吸附酶分子并保持其生物活性, 還對Luminol-H2O2-HRP化學發光體系具有增敏作用. 通過化學發光光譜和紫外光譜表征, 詳細研究了固定化GNPs增強Luminol-

H2O2-HRP體系的化學發光機理. 在優化的實驗條件下, 該傳感器對葡萄糖檢測的線性范圍為0.01 ~ 6.0 mmol/L, 檢測限為5.0 μmol/L (3σ). 將所建立的方法用于臨床血清樣品中葡萄糖含量的測定, 獲得了滿意的結果.

關鍵詞

化學發光傳感器

葡萄糖

金納米粒子

辣根過氧化物酶

葡萄糖氧化酶

1 引言

實現葡萄糖的快速定量檢測在生物化學、臨床化學以及食品分析等領域具有重要意義[1]. 迄今為止,

已有許多有關葡萄糖檢測方法的報道, 如電化學檢測[1~6], 電致發光檢測[7], 表面增強拉曼散射光譜檢測, 光度法檢測和化學發光檢測[8][9][10~15]HRP?

H2O2

+ luminol

??? 3-aminophthalic acid + h? (2)

化學發光分析技術具有儀器設備簡單, 檢測限低和線性范圍寬等優點. 近年來, 化學發光酶傳感器以其高靈敏度, 高通量分析, 易于操作和微型化等優點引起了人們的廣泛關注[16~18]. 在諸多化學發光雙酶測定葡萄糖的研究報道中, 以魯米諾化學發光體系應用最為廣泛. 例如: Economou A等結合流動注射/順序注射分析技術, 建立了一種快速測定葡萄糖的方法, 對葡萄糖檢測的線性范圍為0.01 ~ 1

mmol/L[10]. 一些催化劑如金屬離子、金屬螯合物、納米粒子和酶等都能有效的增強該體系的化學發光強等. 其中采用葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根過氧化物酶(HRP)研制的雙酶傳感器, 由于具有選擇性好, 靈敏度高等優點而得到了廣泛應用. 雙酶反應體系的催化反應機理如下:

GOD? ?-D-gluco + O2 + H2O

??? gluconolacton + H2O2

(1)

度[19]. 近年來, 以金納米粒子作為催化劑增強魯米諾1

林潔華等: 基于固定化納米金增強化學發光雙酶傳感器測定葡萄糖

化學發光的研究相繼有文獻報道[20~25]. HRP作為

化學發光檢測中應用最為普遍的酶之一, 通過催

化H2O2氧化Luminol從而提高化學發光反應的效

率. 苯酚衍生物、二氧化碳、熒光素、苯基硼酸等化合物均可作為該體系的發光增強劑[26], 可增強Luminol-H2O2-HRP體系的發光效率. Miró等報道了以Co(II)作為Luminol-H2O2-HRP化學發光體系的增強劑, 建立了一種雙酶傳感器測定葡萄糖的方法[11].

目前, 以固定化金納米粒子(GNPs)作為增敏劑增強Luminol- H2O2-HRP化學發光體系的研究還未見文獻報道.

章竹君等用蛋殼膜作為GOD和HRP的固定載體,

研制了一種新型的雙酶傳感器, 對葡萄糖檢測的線性范圍為0.001 ~ 0.1 mmol/L[15]. 殼聚糖作為一種性能優良的天然聚合物, 具有無毒、附著力強、生物兼容性好以及對環境友好等優點[27], 可用作酶的固定化載體. GNPs-殼聚糖復合膜能有效地維持生物分子的活性, 被視為一種新型的生物分子固定化載體[28~30].

本工作采用GNPs-殼聚糖膜固定HRP和GOD, 構建了一種雙酶傳感器, 采用流動注射化學發光分析測定葡萄糖. 首次提出以固定化GNPs作為增強劑, 建立了Luminol-H2O2-HRP-GNPs增強化學發光新體系,

并對其增強機理進行了探討.

2 實驗部分

2.1 試劑及標準溶液

殼聚糖(MW 1.9 ~ 3.1?105; 脫乙酰度85% ~ 90%,

Aldrich), Luminol(ABCR GmbH & Co. KG, 德國),

H2O2(AR, 上海化學試劑廠), β-D-葡萄糖(AR, 沈陽試劑公司), γ-環氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS, 南京化學試劑廠), 葡萄糖氧化酶(GOD, 146 U/mg,

Sigma), 辣根過氧化物酶(HRP, 300 U/mg, Sigma),

玻璃微珠(<200 μm, 河北永清玻璃制品有限公

司). 其他試劑均為分析純, 使用時未經進一步提純.

0.01 mol/L Luminol儲備液: 稱取0.1772 g固體Luminol溶于0.1 mol/L NaOH溶液中, 搖勻, 避光保存, 使用時用0.1 mol/L pH 9.2的Tris-HCl緩沖溶液稀釋至所需濃度. 2%殼聚糖溶液(wt%): 稱取1 g殼聚

2

糖固體粉末, 溶于50 mL 1%的醋酸溶液中, 搖勻備用. 1.0 mmol/L H2O2溶液: 移取10.2 μL 30% H2O2于100 mL蒸餾水中, 搖勻備用. 實驗室用水為二次蒸餾水.

2.2 儀器

IFFM-E型流動注射化學發光分析儀(西安瑞邁分析儀器有限公司), 0.1 mol/L pH 6.8磷酸鹽緩沖溶液(PBS)作為葡萄糖的載流. JEM 1200EX型透射電子顯微鏡(JEOL, 日本). Cary 50型紫外分光光度計(Varian Pty Ltd, 澳大利亞). 化學發光光譜在F-4500熒光分光光度計(Hitachi, 日本)上測得, 檢測時關閉激發光源.

2.3 GNPs-殼聚糖復合膜的合成

采用檸檬酸鈉還原法制得粒徑分別為25, 40及60 nm的金溶膠[30], 通過TEM表征, 得到的三種GNPs的平均粒徑分別為(25 ± 2.5) nm, (40 ± 3.0) nm及(60 ± 5.0) nm. 然后將金溶膠分別與10 mL 2%的羧基化殼聚糖溶液混合均勻.

用新配制的混酸(HNO3:HCl=1:3)清洗玻璃微珠,

用二次蒸餾水徹底沖洗干凈后晾干. 對玻璃微珠表面進行硅烷化預處理后[27], 在其表面包覆一層GNPs-殼聚糖膜, 于40℃下烘干2 h.

2.4 化學發光雙酶葡萄糖傳感器的研制

將GNPs-殼聚糖修飾的玻璃微珠分別置于1 mL

4×10?4 g/mL HRP溶液和1 mL 5×10?4 g/mL GOD溶液中吸附酶分子24 h, 并于4℃冰箱保存. 將固定了GOD(或HRP)的玻璃微珠填充到12 cm長的透明塑料管中(3.0 mm i.d.)制成GOD(HRP)傳感器. 如圖1所

示, 在進行流動注射化學發光檢測時, 當葡萄糖標準溶液恰好充滿GOD傳感器時, 立即將管路的b和d兩端連接起來形成回路. 當GOD與葡萄糖樣品反應完全后, 斷開b和d兩端使管路恢復原狀, 此時反應產生的H2O2通過控制換向閥被載入到流通池內, 在光電倍增管正上方的HRP傳感器中與Luminol溶液混合, 在固定化GNPs的增敏作用下, 由IFFM-E型流動注射化學發光分析儀檢測化學發光信號.

圖1 流動注射化學發光雙酶傳感器測定葡萄糖示意圖

3 結果與討論

3.1 GNPs對Luminol-H2O2-HRP化學發光體系的增強作用

研究了固定化GNPs對Luminol-H2O2-HRP化學發光體系的影響. 結果表明, 殼聚糖中摻雜的GNPs顯著增強Luminol-H2O2-HRP體系的化學發光強度,

結果如圖2所示. 然而, 不同粒徑的固定化GNPs對Luminol-H2O2-HRP化學發光體系的增強作用差別很小(圖2中未顯示), 該結果與報道的溶液狀態下, 不同粒徑金溶膠對Luminol-H2O2-HRP化學發光體系增強作用不同的結論不符[25].

Luminol-H2O2-HRP-固定化GNPs增強化學發光體系的發光光譜如圖3所示, 結果表明, Luminol-

H2O2-HRP-固定化GNPs增強化學發光體系的最大發射波長為425 nm, 與Luminol-H2O2化學發光體系的最大發射波長相同. 表明該體系的發光體仍然是3-氨基鄰苯二甲酸鹽陰離子, 沒有新的發光體生成. 化學發光的增強作用可能是由于GNPs的催化效應, 加速了體系的電子轉移速率, 這與文獻[25,31]報道的機理相一致.

通過紫外光譜進一步研究了Luminol-H2O2-HRP-固定化GNPs增強化學發光體系的發光機理, 如圖4所示. 結果表明, 與金溶膠 (曲線(e))相比, 摻雜在殼

中國科學 B輯: 化學 200x年 第xx卷 第xx期

圖2 固定化GNPs對Luminol-H2O2-HRP化學發光體系的增強作用

實驗條件: 1.0 mmol/L Luminol溶液; 0.1 mol/L Tris-HCl溶液(pH

9.25); 1.0 mmol/L H2O2溶液. (a) Luminol + H2O2; (b) luminol +

H2O2 + GNPs; (c) luminol + H2O2 + HRP; (d) luminol + H2O2 + HRP

+ GNPs

圖3 Luminol-H2O2-HRP-固定化GNPs增強化學發光體系的化學發光光譜

實驗條件: 1.0 mmol/L Luminol溶液; 0.1 mol/L pH 9.25 Tris-HCl溶液; 1.0 mmol/L H2O2溶液. (a) Immobilized GNPs; (b) luminol +

H2O2; (c) luminol + H2O2 + GNPs; (d) luminol + H2O2 + HRP; (e)

luminol + H2O2 + HRP + GNPs

聚糖中的GNPs的吸收波長 (曲線(f))沒有出現紅移,

表明固定在殼聚糖膜內的GNPs沒有發生團聚現象.

固定化GNPs在化學發光反應前后, 紫外吸收波長沒有發生改變 (曲線(f), (g)), 該結果與文獻報道的結果相吻合[25], 進一步證明了GNPs的催化效應.

3

林潔華等: 基于固定化納米金增強化學發光雙酶傳感器測定葡萄糖

催化H2O2氧化Luminol的反應從而促進化學發光,

首先, HRP與H2O2反應形成氧化態HRP(HRP I), HRP

I與Luminol陰離子反應形成半還原態酶(HRP II)和激發態Luminol[32]. 摻雜的GNPs充當了反應的電子轉移媒介, 加快了固定在其表面的HRP經HRP I和HRP II轉變為還原態(HRP)的速率, 從而起增強作用.

3.2 化學發光檢測條件的優化

雙酶傳感器的性能主要取決于化學發光反應中Luminol溶液的濃度、緩沖溶液的pH值, 以及GOD催化氧化葡萄糖的反應條件. 優化檢測條件的結果

如圖5所示. 以0.1 mol/L PBS緩沖液作為1.0 mmol/L葡萄糖樣品的載流, 在GOD傳感器中反應4 min, 從而確定Luminol的反應pH和濃度. 圖5(a)表明, 當0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液pH值為9.2時, 化學發光信號最強. 圖5(b)表明, 當Luminol溶液濃度在0.05 ~ 1.0 mmol/L之間時, 該體系的化學發光強度隨Luminol溶液濃度的增加而增加, 當濃度達到1.0

mmol/L時, 化學發光強度基本達到峰值, 然后隨著Luminol溶液濃度的增加, 發光信號反而降低. 因此,

圖4 不同底物溶液的紫外光譜

(a) H2O2; (b) luminol; (c) HAuCl4; (d) 檸檬酸鈉; (e) 溶液中的GNPs; (f) 固定化的GNPs; (g) 化學發光反應后固定化的GNPs

綜上所述, 固定化GNPs對Luminol-H2O2-HRP化學發光體系具有明顯的增強作用, 并且, GNPs的粒徑大小對化學發光的增強作用影響不大. 由此推斷, Luminol-H2O2體系化學發光的增強很可能是由摻雜的GNPs和HRP的協同催化效應引起的. HRP能夠

圖5 葡萄糖測定實驗條件優化

(a) Luminol 溶液pH值; (b) luminol溶液濃度; (c)葡萄糖的酶催化反應時間; (d)葡萄糖濃度. 實驗條件: 1.0 mmol/L葡萄糖溶液; 0.1 mol/L

PBS緩沖液; 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液

4

選擇Luminol溶液的最佳pH值為9.2, 最佳濃度1.0

mmol/L.

在最佳實驗條件下, 試驗了GOD催化氧化葡萄糖反應時間的影響, 如圖5(c)所示. 結果表明,葡萄糖在GOD傳感器中流通的時間越長, 兩者的反應時間越長, 產生的H2O2的量越大. 但是, 反應時間太長會使整個分析過程延長. 因此, 選擇催化氧化反應時間為4 min. 試驗了葡萄糖載流酸度的影響, 如圖5(d)所示. 結果表明, 當PBS緩沖溶液的pH值為6.8時,

體系的化學發光信號最強. 因此, 檢測中選擇GOD酶催化反應的最佳pH值為6.8.

3.3 葡萄糖的檢測

在最佳實驗條件下對葡萄糖標準溶液進行了測定, 結果如圖6所示. 結果表明, 對葡萄糖檢測的線性范圍為0.01 ~ 6.0 mmol/L, 線性方程為I =

42.87(±27) + 1566(±11)C (其中, I為體系的化學發光強度, C為葡萄糖濃度, mmol/L), 線性相關系數為0.9997(n=10), 檢測限為5.0 μmol/L(3σ). 與文獻報道的化學發光葡萄糖傳感器[10,13]相比, 本方法靈敏度高, 檢測限低且線性范圍寬.

圖6 流動注射化學發光雙酶傳感器測定葡萄糖的工作

曲線

3.4 干擾試驗

為檢測血清中葡萄糖的含量, 研究了血清中共存組分的干擾. 結果表明, 當葡萄糖溶液濃度為0.5

中國科學 B輯: 化學 200x年 第xx卷 第xx期

mmol/L時, 1000倍的Na+, K+, Ca2+, Cl?, NO3?, PO43?和SO42?; 100倍的尿素和50倍的尿酸不干擾測定. 這說明該生物傳感器具有良好的選擇性.

3.5 血清樣品測定

對人血清中葡萄糖的含量進行了測定, 見表1所示. 結果表明, 該方法和醫院采用的臨床分析方法所得結果相吻合. 為進一步驗證該方法的準確性, 采用標準加入法測定了樣品的回收率, 見表2. 結果表明,

回收率在96% ~ 105%之間, 方法準確, 可用于臨床樣品的測定.

表1 血清樣品中葡萄糖的測定

樣品

醫院臨床本方法 相對偏差

/mmol?L?1 /mmol?L?1, n=5

/%, n=5

Serum 1 0.29 0.23 2.62

Serum 2 1.28 1.37 1.28

Serum 3 5.60 5.28 0.87

Serum 4 4.90 5.40 1.75

表2 樣品中葡萄糖的回收率測定

樣品

標液加入量測得值

回收率 相對偏差

mmol?L?1 /mmol?L?1, n=5 /%, n=5 /%, n=5

1 0.50 0.48 96.00 2.32

2 1.50 1.57 104.67 1.86

3 3.50 3.58 102.28 1.51

4 4.50 4.38 97.33 2.70

3.6 傳感器的穩定性

傳感器的穩定性主要取決于固定的HRP和GOD的穩定性. 對所研制的傳感器的穩定性進行實驗,

每次測完后將其置于pH 7.0 PBS緩沖溶液中并于4℃冰箱保存. 結果表明, 傳感器保存3周后測得的發光信號沒有明顯的降低, 5周后測得信號大約降低到初始值的85%, 之后的兩個月內信號基本保持不變. 另外, 為確定該傳感器的操作穩定性, 對濃度為1.0

mmol/L的葡萄糖標準溶液進行了50次連續測定, 相對標準偏差為1.9%. 說明固定在GNPs-殼聚糖膜上的酶能夠保持良好的生物活性, 傳感器具有較好的穩定性.

5

林潔華等: 基于固定化納米金增強化學發光雙酶傳感器測定葡萄糖

4 結論

本文構建了一種快速、高效的測定葡萄糖含量的流動注射化學發光雙酶傳感器. 以GNPs摻雜的殼聚糖膜作為HRP和GOD的固定化載體, 可以有效地固定HRP和GOD酶分子, 而摻雜的GNPs對Luminol-

H2O2-HRP化學發光體系具有增敏作用. 固定化的GNPs充當了反應的電子轉移媒介并加速了化學發光

反應中酶的催化作用. 由于固定化的HRP與GNPs的協同催化效應, 該方法對葡萄糖的檢測靈敏度高,

檢測限低, 且線性范圍寬. 所構建的生物傳感器已成功地用于血清樣品中葡萄糖的測定. 固定化GNPs作為Luminol-H2O2-HRP化學發光體系的一種新型增強劑, 在酶分析和免疫分析等領域具有較好的應用

價值.

參考文獻

1 De Benedetto G E, Palmisano F, Zambonin P G. One-step fabrication of a bienzyme gluco nsor bad on gluco oxida and

peroxida immobilized onto a poly(pyrrole) modified glassy carbon electrode. Bions Bioelectron, 1996, 11: 1001—1008

2 唐芳瓊, 孟憲偉, 陳東, 冉均國, 茍立, 鄭昌瓊. 納米顆粒增強的葡萄糖生物傳感器. 中國科學B輯: 化學, 2000, 30:

119—124

3 Delvaux M, Walcarius A, Demoustier C S. Bienzyme HRP-GOx-modified gold nanoelectrodes for the nsitive amperometric detec-tion of gluco at low overpotentials. Bions Bioelectron, 2005, 20: 1587—1594

4 Zhu L D, Yang R L, Zhai J L, Tian C Y. Bienzymatic gluco bionsor bad on co-immobilization of peroxida and gluco oxida

on a carbon nanotubes electrode. Bions Bioelectron, 2007, 23: 528—535

5 蔡稱心, 陳靜, 陸天虹. 碳納米管修飾電極上葡萄糖氧化酶的直接電子轉移. 中國科學B輯: 化學, 2003, 33: 511—518

6 Ferri T, Maida S, Poscia A, Santucci R. A gluco bionsor bad on electro-enzyme catalyzed oxidation of gluco using a

HRP-GOD layered asmbly. Electroanalysis, 2001, 13: 1198—1202

7 Marquette C A, Blum L J. Luminol electrochemiluminescenc-bad fiber optical bionsors for flow injection analysis of gluco and

lactate in natural samples. Anal Chim Acta, 1999, 381: 1—10

8 Wu Z S, Zhou G Z, Jiang J H, Shen G L, Yu R Q. Gold colloid-bienzyme conjugates for gluco detection utilizing surface-enhanced

Raman scattering. Talanta, 2006, 70: 533—539

9 Zhu M, Huang X M, Shen H X. Microbial enzymatic assay of gluco in rum. Anal Chim Acta, 1997, 349: 165—170

10 Panoutsou P, Economou A. Rapid enzymatic chemiluminescent assay of gluco by means of a hybrid flow-injection/quen- ti-al-injection method. Talanta, 2005, 67: 603—609

11 Manera M, Miró M, Estela J M, Cerdà V. A multisyringe flow injection system with immobilized gluco oxida bad on homoge-neous chemiluminescence detection. Anal Chim Acta, 2004, 508: 23—30

12 Nicolau P, Manuel M, José M E, Víctor C. Automated enzymatic assays in a renewable fashion using the multisyringe flow injection

scheme with soluble enzymes. Anal Chem, 2004, 76: 773—780

13 Li B, Zhang Z, Jin Y. Plant tissue-bad chemiluminescence flow bionsor for glycolic acid. Anal Chem, 2001, 73: 1203—1206

14 Zhang X R, Baeyenes W R G, Garcia C A M , Ouyang J. Recent developments in chemiluminescence nsors. Trends Anal Chem,

1999, 18: 384—391

15 Li B X, Lan D, Zhang Z J. Chemiluminescence flow-through bionsor for gluco with eggshell membrane as enzyme immobilization

platform. Anal Biochem, 2008, 374: 64—70

16 Li B, Zhang Z. Chemiluminescence flow bionsor for determination of total D-amino acid in rum with immobilized reagents. Sen-sor Actuat B, 2000, 69: 70—74

17 Aboul-Enein H Y, Stefan R I, van Staden J F, Zhang X R, Garcia C A M, Baeyens W R G. FA non-potentiometric nsing method for

the determination of sulfite. Crit Review Anal Chem, 2000, 30: 271—289

18 Kiba N, Miwa T, Tachibana M, Tani K, Koizumi H. Chemiluminometric nsor for simultaneous determination of L-Glutamate and

L-Lysine with immobilized oxidas in a flow injection system. Anal Chem, 2002, 74: 1269—1274

19 Kricka L J, Voyta J C, Bronstein I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Meth Enzymol, 2000,

305: 370—390

6

中國科學 B輯: 化學 200x年 第xx卷 第xx期

20 Niazov T, Pavlov V, Xiao Y, Gill R, Willner I. DNAzyme-functionalized Au nanoparticles for the amplified detection of DNA or te-lomera activity. Nano Lett, 2004, 4: 1683—1687

21 Wang Z P, Hu J Q, Jin Y, Yao X, Li J H. In situ amplified chemiluminescent detection of DNA and immunoassay of IgG using spe-cial-shaped gold nanoparticles as label. Clin Chem, 2006, 10: 1958—1961

22 Corgier B P, Li F, Blum L J, Marquette C A. On-chip chemiluminescent signal enhancement using nanostructured gold-modified car-bon microarrays. Langmuir, 2007, 23 (16): 8619—8623

23 Li Y X, Yang P, Wang P, Wang L. Development of a novel luminol chemiluminescent method catalyzed by gold nanoparticles for de-termination of estrogens. Anal Bioanal Chem, 2007, 387(2): 585—592

24 Wang L, Yang P, Li Y X, Chen H Q, Li M G, Luo F B. A flow injection chemiluminescence method for the determination of fluoro-quinolone derivative using the reaction of Luminol and hydrogen peroxide catalyzed by gold nanoparticles. Talanta, 2007, 72(3):

1066—1072

25 Zhang Z F, Cui H, Lai C Z, Liu L J. Gold nanoparticle-catalyzed luminol chemiluminescence and its analytical applications. Anal

Chem, 2005, 77: 3324—3329

26 Lin J H, Yan F, Ju H X. Noncompetitive enzyme immunoassay for carcinoembryonic antigen by flow injection chemiluminescence.

Clin Chim Acta, 2004, 341: 109—115

27 Lin J H, Yan F, Hu X Y, Ju H X. Chemiluminescent immunonsor for CA19-9 bad on antigen immobilization on cross-linked chi-tosan membrane. J Immun Meth, 2004, 291: 165—174

28 Hao C, Ding L, Zhang X J, Ju H X. Biocompatible conductive architecture of carbon nanofiber-doped chitosan prepared with con-trollable electrodeposition for cytonsing. Anal Chem, 2007, 79: 4442—4447

29 Huang H Z, Yang X R. Chitosan mediated asmbly of gold nanoparticles multiplayer. Colloids Surf A: Physicochem Eng Aspects,

2003, 226: 77—86

30 Lin J H, Qu W, Zhang S S. Disposable bionsor bad on enzyme immobilized on Au-chitosan modified ITO electrode with flow in-jection amperometric analysis. Anal Biochem, 2007, 307: 288—293

31 Wallace W T; Whetten R L. Coadsorption of CO and O2 on lected gold clusters: Evidence for efficient room-temperature CO2 gen-eration. J Am Chem Soc, 2002, 124: 7499—7505

32 Dodeigne C, Thunus L, Lejeune R. Chemiluminescence as diagnostic tool. Talanta, 2000, 51: 415—439

7