2020版高考生物總復習考點加強課6教案(最新整理)

2023年12月4日發(作者：我的性啟蒙老師袁老師)

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考點加強課6

1。限制酶的選擇原則

（1）根據目的基因兩端的限制酶切點確定限制酶的種類

①應選擇切點位于目的基因兩端的限制酶,以便將目的基因“切出”,如圖甲可選擇PstⅠ。

②不能選擇切點位于目的基因內部的限制酶，以防破壞目的基因，如圖甲不能選擇SmaⅠ。

③為避免目的基因和質粒的自身環化和隨意連接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和質粒，如圖甲也可選擇用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ兩種限制酶（但要確保質粒上也有這兩種酶的切點），而且這種切點不致于破壞所有的“標記基因”以及啟動子和終止子。

（2）根據質粒的特點確定限制酶的種類

①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶相一致，以確保具有相同的黏性末端.

②質粒作為載體必須具備標記基因等，所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構，應至少含有一個完好的標記基因,如圖乙中限制酶pst Ⅰ因其會破壞標記基因而不宜選擇。

③所選限制酶切點不應位于復制原點處以防破壞復制原點，如果所選酶的切點不止一個，則切割重組后可能會丟失某些片段，若丟失的片段含復制原點區，則切割重組后的片段進入受體細胞后不能自主復制。

④所選限制酶，其切點應位于啟動子與終止子之間，如圖乙中HindⅢ會破壞啟動子，EcoRⅠ會破壞終止子，而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可讓目的基因嵌入啟動子與終止子之間。 （3）參考Ti質粒的T－DNA片段選擇限制酶

若質粒上標出T－DNA片段，則所選限制酶切點應位于T－DNA片段中，從而有利于將目的基因嵌入到T－DNA片段上——因為Ti質粒的T－DNA片段最易轉移至受體細胞并且整合到受體細胞染色體DNA上，如用兩種限制酶Xba Ⅰ和Sac Ⅰ（兩種酶切出的黏性末端不同）切割某DNA，獲得含目的基因的片段。若利用該片段構建基因表達載體，則下圖中甲、乙、丁，Ti質粒均不宜選擇，而丙Ti質粒宜選取。(分析如下）

2.目的基因的檢測與鑒定

（1)界定“標記基因”與“DNA分子雜交技術”在目的基因檢測中的作用:

①載體上標記基因的標記原理

載體上的標記基因一般是一些抗生素的抗性基因.目的基因要轉入的受體細胞沒有抵抗相關抗生素的能力.當含有抗生素抗性基因的載體進入受體細胞后，抗性基因在受體細胞內表達，使受體細胞能夠抵抗相應抗生素,所以在受體細胞的培養體系中加入該種抗生素就可以只保留轉入載體的受體細胞，倘若在選擇培養基中不能存活,則表明無質粒轉入，當然不會有“目的基因”轉入，能存活時必含該載體，原理如下圖所示：

②“標記基因”篩選后為何還需應用“DNA分子雜交技術"確認目的基因是否轉入?

經上述步驟篩選得到的受體細胞，只是含特定的標記基因的質粒,然而,該質粒上是否成功嵌入了目的基因，還不能確定，故仍需使用“目的基因"作探針,利用DNA分子雜交技術，檢測受體細胞的質粒上是否含目的基因。

（2)使用“目的基因”作探針，運用“分子雜交技術”檢測目的基因是否轉錄出特定mRNA。

（3）采用“抗原—抗體雜交技術”，從轉基因生物中提取蛋白質（作抗原）與相應抗體雜交，依據是否出現雜交帶確認目的基因是否“指導”特定蛋白質的合成。

(4）采用抗蟲、抗病毒等“接種實驗”進行目的基因成功表達的“個體生物學”水平的檢測。

【例證】 （2016·全國卷Ⅲ,40)圖(a）中的三個DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三種限制性內切酶的識別序列與切割位點，圖(b）為某種表達載體的示意圖（載體上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切點是唯一的）。

根據基因工程的有關知識,回答下列問題：

（1）經BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以與上述表達載體被 酶切后的產物連接，理由是____________________________________________________

_____________________________________________________________________

（2）若某人利用圖（b)所示的表達載體獲得了甲、乙、丙三種含有目的基因的重組DNA分子，如圖（c)所示,這三種重組DNA分子中，不能在宿主細胞中表達目的基因產物的有 ，不能表達的原因是________________________

_____________________________________________________________________

圖(c）

（3）DNA連接酶是將兩個DNA片段連接起來的酶,常見的有 和 ，其中既能連接黏性末端又能連接平末端的是____________________.

［慧眼識圖 獲取信息］

（1)三種限制酶切割結果分析 （2）表達載體與重組DNA分子分析

答案 （1）Sau3AⅠ 兩種酶切割后產生的片段具有相同的黏性末端 （2）甲、丙 甲中目的基因插入在啟動子的上游，丙中目的基因插入在終止子的下游，二者的目的基因均不能被轉錄 （3）E·coliDNA連接酶 T4DNA連接酶 T4DNA連接酶

1。（2018·南京、鹽城、連云港二模）人類是乙型肝炎病毒的唯一宿主，接種乙肝疫苗是預防乙肝病毒感染的最有效方法.下圖為“轉基因酵母乙肝疫苗”的生產過程示意圖,該過程所用酵母菌為畢赤酵母菌，其體內無天然質粒，科學家改造出了下圖所示的pPIC9K質粒（松弛控制型，復制不受宿主細胞控制）用作載體，其與目的基因形成的重組質粒經酶切后可以與酵母菌染色體發生同源重組,將目的基因整合于染色體中以實現表達。請回答下列問題:

（1）如果要將 HBsAg基因和pPIC9K質粒重組，應該在 HBsAg基因兩側的A和B位置接上限制酶 的識別序列,這樣設計的優點是可避免質粒和目的基因的自身環化。步驟1應選用 （選填“E·coli”或“T4"）DNA連接酶。

（2）步驟2的目的是 。已知大腸桿菌每20 min分裂一次，若1個大腸桿菌中導入了10個重組質粒，則1 h后可從1個大腸桿菌的后代中得到重組質粒的個數 .

(3)步驟4中應選用限制酶 切割重組質粒以獲得一段線性DNA，然后將其導入畢赤酵母菌細胞。為了確認畢赤酵母菌轉化是否成功，應在培養基中加入 以便篩選.除此以外,還可以用分子雜交技術鑒定上圖中的畢赤酵母菌轉化是否成功，過程如下圖所示：

根據圖中顯示結果推算,若要獲得16個成功導入該基因的酵母菌菌落，則上圖A中的酵母菌菌落數至少要為 個.

(4)已知質粒在細胞傳代過程中有丟失現象，試分析畢赤酵母表達系統的遺傳穩定性高于大桿菌表達系統的主要原因是________________________________。

解析 （1）如果要將 HBsAg基因和pPIC9K質粒重組,HBsAg基因插入的位置應該在pPIC9K質粒的啟動子和終止子之間,pPIC9K質粒的啟動子和終止子之間有限制酶SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ的識別位點，所以在 HBsAg基因兩側的A和B位置要接上限制酶SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ的識別序列,可避免質粒和目的基因的自身環化。限制酶SnaB Ⅰ切割后是平末端，限制酶Avr Ⅱ切割后是黏性末端，而T4DNA連接酶既可連接平末端又可連接黏性末端，所以步驟1應選用T4DNA連接酶.（2）步驟2是將重組質粒導入大腸桿菌體內進行擴增，以獲得大量重組質粒。pPIC9K質粒是松弛控制型，復制不受宿主細胞控制,所以無法確定1個大腸桿菌復制3次后得到重組質粒的個數。(3）由步驟4中獲得的一段線性DNA兩側序列可知，應選用限制酶Bgl Ⅱ切割重組質粒，該線性DNA中含卡拉霉素抗性基因，應在培養基中加入卡拉霉素以便篩選轉化成功的畢赤酵母菌。由圖可知，圖A中的酵母菌菌落數為15個時，用分子雜交技術鑒定有2個轉化成功，所以要獲得16個成功導入該基因的酵母菌菌落，圖A中的酵母菌菌落數至少要為16÷2×15＝120個.（4） 畢赤酵母表達系統中目的基因整合到酵母染色體上，不易丟失，而大腸桿菌表達系統中質粒在細胞傳代過程中有丟失現象，所以畢赤酵母表達系統的遺傳穩定性更高.

答案 （1）SnaB Ⅰ和Avr Ⅱ T4 （2）獲得大量重組質粒（擴增） 不確定 （3)Bgl Ⅱ

卡拉霉素 120 (4）目的基因整合到酵母染色體上，不易丟失

2。（2018·淮中、南師附中、海門、天一四校聯考）基因表達載體的構建是基因工程的核心。圖1為限制酶EcoRⅠ的識別序列，圖2表示目的基因及限制酶切點，圖3表示目的基因上的DNA片段，圖4表示質粒。回答下列問題：

(1）若用圖1所示的限制酶EcoRⅠ切割外源DNA，就其特異性而言，切開的是

之間相連的化學鍵。

（2）圖3為目的基因中的某一片段，下列有關敘述正確的是 （多選）。

A.若圖中的ACT能決定一個氨基酸，則ACT可稱為一個密碼子

B。DNA聚合酶和DNA連接酶都可作用于②處，解旋酶作用于①處

C。若只用這個片段中的3個堿基對,排列出的DNA片段有64種

D.就游離的磷酸基而言，該片段與重組質粒相比多了2個游離的磷酸基

（3)若利用PCR技術增加目的基因的數量,由圖2可知,A、B、C、D 4種單鏈DNA片段中應選取 作為引物（DNA復制子鏈的延伸方向5′→3′）.該DNA分子在PCR儀中經過4次循環后會產生等長的目的基因片段 個。

（4）為了使目的基因和質粒定向連接并且有利于受體細胞的篩選，提高重組效率，應該選擇的限制酶是 。如果用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同時對質粒進行切割，假設同時只有任意兩個位點被切斷且每次機會相等,則形成含有完整抗四環素基因的DNA片段有

種。

（5）如果大腸桿菌是受體細胞，則其體內應不含 基因，以利于篩選出含重組質粒的受體菌.目的基因能在大腸桿菌細胞內表達出相同的蛋白質,其遺傳學基礎是_____________________________________________________。

解析 （1）限制酶EcoRⅠ識別序列為GAATTC,切割位點在G與A之間，切開的是鳥嘌呤脫氧核苷酸和腺嘌呤脫氧核苷酸之間相連的磷酸二酯鍵。（2）決定氨基酸的密碼子在mRNA上，A錯誤；DNA聚合酶和DNA連接酶都可作用于②磷酸二酯鍵處，解旋酶作用于①氫鍵處，B正確;假設只用這個片段中的3個堿基對,排列出的DNA片段一定小于64種,C錯誤；該片段含2個游離的磷酸基團，重組質粒是環狀DNA，不含游離的磷酸基團，D正確。（3）由于DNA復制時子鏈的延伸方向為5′→3′，所以選C和B作為引物。該DNA分子在PCR儀中經過3次循環后會產生2個等長的目的基因片段，經過n次循環后產生等長的目的基因片段為2-2n個，4次循環后會產生等長的目的基因片段8個。（4）為了使目的基因和質粒定向連接應該選擇雙酶切，質粒上至少要有一個標記基因存在，所以用限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。用限制酶nPstⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ同時對質粒進行切割,若順時針方向PstⅠ與EcoRⅠ之間的片段為a,EcoRⅠ與HindⅢ之間的片段為b，HindⅢ與PstⅠ之間的片段為c,則只有任意兩個位點被切斷且每次機會相等時，形成的片段有a、b＋c、b、a＋c、c、a＋b，其中含有完整抗四環素基因的DNA片段只有b＋c這1種。（5)經以上分析，重組質粒構建時,抗青霉素基因被破壞,只保留了抗四環素基因，所以為了篩選出含重組質粒的受體菌，受體細胞中應不含標記基因抗四環素基因。由于所有生物共用一套遺傳密碼子，所以目的基因能在大腸桿菌細胞內表達出相同的蛋白質.

答案 (1）鳥嘌呤脫氧核苷酸和腺嘌呤脫氧核苷酸

(2）BD （3）B和C 8 （4）Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ 1 （5）抗四環素 各種生物共用一套遺傳密碼子

課后·加強訓練

（時間：20分鐘）

1.（2016·全國卷Ⅰ，40）某一質粒載體如圖所示，外源DNA插入到Amp或Tet中會導致相應的基因失活（Amp表示氨芐青霉素抗性基因，Tet表示四環素抗性基因).有人將此質粒載體用BamHⅠ酶切后，與用BamHⅠ酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進行連接反應,用得到的混合物直接轉化大腸桿菌，結果大腸桿菌有的未被轉化,有的被轉化。被轉化的大腸桿菌有三種，分別是含有環狀目的基因、含有質粒載體、含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌.回答下列問題:

rrrr （1）質粒載體作為基因工程的工具，應具備的基本條件有__ _____________

（答出兩點即可），而作為基因表達載體，除滿足上述基本條件外,還需具有啟動子和終止子。

（2）如果用含有氨芐青霉素的培養基進行篩選，在上述四種大腸桿菌細胞中，未被轉化的和僅含環狀目的基因的細胞是不能區分的，其原因是___________________________________________________________________；

并且 和 的細胞也是不能區分的，其原因是____________________________________________________________________。

在上述篩選的基礎上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌的單菌落,還需使用含有 的固體培養基.

（3）基因工程中，某些噬菌體經改造后可以作為載體，其DNA復制所需的原料來自于_________________________________________________________。

解析 （1）作為運載體必須具備如下特點：①能自主復制,從而在受體細胞中穩定保存；②含標記基因，以供重組DNA的鑒定和篩選；③具一個至多個限制酶切割位點以便外源DNA插入。(2）在含有氨芐青霉素的培養基上，只有具有Amp的大腸桿菌才能夠生長。而Amp位于質粒上，故未被轉化的和僅含環狀目的基因的大腸桿菌細胞中無Amp，不能在培養基中生長,而僅含有質粒載體的和含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌均具有Amp因而能在培養基中生長。目的基因的插入破壞了質粒載體的Tet，故含有插入了目的基因的重組質粒的大腸桿菌不能在含有四環素的平板上生長，從而與僅含有質粒載體的大腸桿菌得以區分。（3）噬菌體是病毒,無細胞結構，無法自主合成DNA，需借助宿主細胞完成DNA復制.

答案 （1)能自我復制、具有標記基因

（2）二者均不含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養基上均不生長 含有質粒載體 含有插入了目的基因的重組質粒（或答含有重組質粒） 二者均含有氨芐青霉素抗性基因,在該培養基上均能生長 四環素

(3）受體細胞

2.（2018·鹽城三模）薄荷可產生蚜蟲報警信息素EβF,用于驅散蚜蟲并吸引蚜蟲的天敵。通過基因工程可制備含EβF合成酶基因的轉基因抗蚜麥.請回答問題：

rrrrr（1)薄荷利用EβF驅散蚜蟲并吸引蚜蟲的天敵，體現了生態系統的信息傳遞具有 ， 維持生態系統穩定性的功能。

（2）若利用PCR技術獲取EβF合成酶基因，在PCR反應體系中需加入 、模板序列、原料及兩種 .如果提取到薄荷細胞中EβF合成酶的mRNA，則可用 法獲取目的基因。

(3）研究者利用4種限制酶切割目的基因和質粒，各限制酶的識別序列和切割位點如下圖所示。酶切后的產物連接時，目的基因上Sal Ⅰ切割產生的末端應與質粒上 切割產生的末端相連接。連接完成后，該連接點 （選填“能”或“不能”）被這兩種限制酶中的某一種切割.

（4）欲從個體水平上檢測轉基因抗蚜麥是否培育成功,在小麥葉片上接種蚜蟲后，通過觀察葉片上蚜蟲的 或 作為判定的依據.

(5)下列屬于轉基因抗蚜麥推廣種植后引發的安全性問題的是 （多選）.

A.小麥不再感染蚜蟲

B.目的基因向其他生物擴散

C.減少殺蟲劑對環境的破壞

D。改變現有生態結構

解析 （1)EβF屬于化學信息，薄荷利用EβF驅散蚜蟲并吸引蚜蟲的天敵，體現了生態系統的信息傳遞具有調節生物種間關系， 以維持生態系統穩定性的功能.(2）PCR反應體系中需加入Taq酶、模板序列（EβF合成酶基因）、4種脫氧核苷酸及兩種引物.利用mRNA可以通過反轉錄法獲取目的基因.（3）目的基因上Sal Ⅰ切割產生的末端為錯誤!，質粒上Xho Ⅰ切割產生的末端也為錯誤!，兩者黏性末端相同，可以連接，連接點的堿基序列變為錯誤!，不是兩種限制酶的識別序列，不能被這兩種限制酶中的某一種切割.

答案 （1)調節生物的種間關系 (2）（耐高溫的）DNA聚合酶（或Taq酶） 引物 反轉錄

(3）XhoⅠ 不能 （4）停留時間 天敵數量 （5)BD

3。嗜熱菌可以生活在98 ℃的高溫環境中，研究發現其耐熱性與基因H的表達產物有關。下圖表示某研究小組利用大腸桿菌對H基因實行的克隆和表達過程，其中NdeⅠ、EcoRⅠ、 HindⅢ、SalⅠ四種限制酶的識別序列和酶切位點分別為CA↓TATG、G↓AATTC、A↓AGCTT、GTCGAC。請分析回答:

↓

（1）圖中的結構A是 ,其主要作用是 .一個完整的基因表達載體組成,除了質粒1中所示結構以外,還應該含有_____________________________________________________________________。

(2）用圖中質粒1和H基因構建重組質粒,應選用 兩種限制酶進行切割,影響限制酶處理效果的因素可能有 （多選）。

①反應溫度 ②緩沖液pH ③限制酶的濃度 ④DNA樣品的純度

（3）PCR反應中引物的設計非常關鍵,據圖分析,擴增H基因時應選擇的一對引物是 。（多選）

A.引物Ⅰ：…GGGAATTC…；引物Ⅱ：…CTCATATG…

B.引物Ⅰ：…GAATTCCC…；引物Ⅱ：…CATATGAG…

C。引物Ⅰ:…GGAAGCTT…；引物Ⅱ：…AAGCTTCC…

D.引物Ⅰ：…CTCATATG…;引物Ⅱ：…AAGCTTAAGCTT…

解析 （1）據題圖分析，由質粒1的結構及質粒1和重組質粒上都具有A可推知,A是啟動子,其作用是提供RNA聚合酶特異性識別結合位點，驅動基因轉錄。一個完整的基因表達載體組成包括啟動子、終止子、目的基因和標記基因,而質粒1中已經含有啟動子和標記基因（抗生素A抗性基因），故答案是目的基因、終止子。

(2)結合四種限制酶的識別序列和酶切位點，確定用圖中質粒1和H基因構建重組質粒，應選用Nde Ⅰ、EcoR Ⅰ兩種限制酶進行切割，影響酶的因素都影響限制酶的處理效果，所以可能有溫度、pH、酶濃度和底物的純度，即①②③④。

(3）分析切割質粒和目的基因的兩種限制酶NdeⅠ、EcoRⅠ的識別序列和切割位點,發現A、B選項的引物Ⅱ中有NdeⅠ的識別序列CATATG，而A、B選項的引物Ⅰ中都有Eco

↓RⅠ的識別序列GAATTC，而C、D中都不含,所以應選擇A、B.

答案 （1)啟動子 提供RNA聚合酶特異性識別結合位點 目的基因、終止子（和復制原點） （2)NdeⅠ、EcoRⅠ ①②③④ (3）AB

4.（2018·蘇錫常鎮三模）基因工程中，GUS基因編碼的酶可將無色底物生成藍色產物，GFP基因會產生綠色熒光蛋白，這兩種基因都可作為標記基因來研究發育生物學的問題。利用雙CRISPR/Cas9系統和Cre/loxP重組酶系統技術可更好地實現該研究。請據圖作答：

↓

(1）圖1為雙CRISPR/Cas9系統作用示意圖.該系統能夠特異性識別DNA序列并切割特定位點的原因分別是 、 。圖中向導RNA與DNA結合的原理是 .將刪除區切割后,轉入基因與原DNA片段可通過形成 拼接起來，形成新的DNA序列.

（2）雙CRISPR/Cas9系統可直接在靶細胞內起作用，與傳統的基因工程相比，該操作無需

（填工具）。與質粒載體導入外源基因比，雙CRISPR/Cas9系統編輯的基因可以不含 .

（3）圖2為Cre/loxP重組酶系統作用示意圖.利用雙CRISPR/Cas9系統可精準地將loxP序列、GUS基因及GFP基因連接，接上35S啟動子之后可在組織中檢測出藍色區而無綠色熒光區，這是由于 基因自身無啟動子而無法表達。Cre基因是重組酶基因,經38 ℃熱處理后可被激活表達，在此前提下組織中可檢測出綠色熒光區，據此分析綠色熒光區形成的原因是 .采用 等技術手段可以擴大組織中綠色熒光區的面積.

解析 （1）圖1中向導RNA有識別序列,能識別特定序列，Cas9 蛋白能定點切割DNA序列，所以該系統能夠特異性識別DNA序列并切割特定位點。圖中向導RNA可以與DNA發生堿基互補配對而結合。切割刪除區后，轉入的基因與原DNA片段可形成磷酸二酯鍵拼接成新的DNA序列.（2）傳統的基因工程需要載體將目的基因導入受體細胞，而雙CRISPR/Cas9系統可直接在靶細胞內起作用，不需要載體。質粒載體導入外源基因需要含啟動子、終止子和標記基因，而雙CRISPR/Cas9系統編輯的基因不需要載體,可以不含啟動子、終止子和標記基因.（3）loxP序列、GUS基因及GFP基因連接，接上35S啟動子之后,GUS基因可以轉錄從而編碼出酶將無色底物生成藍色產物，而GFP基因自身無啟動子無法表達綠色熒光蛋白，所以在組織中可以檢測出藍色區而無綠色熒光區。經38 ℃熱處理后Cre重組酶基因被激活表達，特異性識別切割 loxP 序列，使GFP基因接上35S啟動子得以表達，組織中可檢測出綠色熒光區，所以延長熱處理時間可以擴大組織中綠色熒光區的面積。

答案 （1)向導RNA能識別特定序列 Cas9 蛋白能定點切割DNA序列 堿基互補配對 磷酸二酯鍵 （2）載體 啟動子、終止子和標記基因 （3）GFP 重組酶能（特異性識別并）切割 loxP 序列，使GFP基因得以表達 延長熱處理時間

尊敬的讀者：

本文由我和我的同事在百忙中收集整編出來，本文檔在發布之前我們對內容進行仔細校對，但是難免會有不盡如人意之處，如有疏漏之處請指正，希望本文能為您解開疑惑,引發思考。文中部分文字受到網友的關懷和支持，在此表示感謝！在往后的日子希望與大家共同進步，成長。 This article is collected and compiled by my colleagues and I in our

busy schedule. We proofread the content carefully before the relea of

this article, but it is inevitable that there will be some

unsatisfactory points. If there are omissions, plea correct them. I

hope this article can solve your doubts and arou your thinking. Part

of the text by the ur's care and support, thank you here! I hope to

make progress and grow with you in the future.

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