花椒根腐病生防芽孢桿菌的篩選鑒定及定殖和防治效果

2023年12月6日發(作者：小學寫景作文)

花椒根腐病生防芽孢桿菌的篩選鑒定及定殖和防治效果

李姝江;朱天輝;譙天敏;韓珊

【摘 要】[目的]對花椒根腐病生防芽孢桿菌進行分離、篩選、定殖和防效評價,為開發高效、穩定、持久的生物農藥提供理論與實踐基礎.[方法]采用稀釋平板涂布法分離健康花椒根際土中的芽孢桿菌,利用點菌法和打孔法2次篩選拮抗效果最佳的芽孢桿菌,根據形態特征和生理生化試驗對其進行初步鑒定,并測定其對1年生花椒根腐病的防治效果.用鏈霉素標記拮抗芽孢桿菌,并檢測該菌在花椒根際及根內土壤中的定殖動態,以此為基礎,運用灌根法對花椒根腐病進行預防和治療處理,計算發病率、病情指數和防治效果.[結果]在分離獲得的20株芽孢桿菌中,編號為B3的菌株拮抗作用最強,抑菌圈直徑達26.0 mm,高溫處理后仍具有活性,初步確定其為蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus.盆栽試驗結果表明,花椒根腐病發病率和病情指數隨B3菌株發酵液稀釋倍數增加而增加,B3發酵液原液至稀釋200倍以下防治效果顯著.定殖動態試驗結果表明,無論病原菌存在與否,抗300 μg/mL鏈霉素的突變菌株均能在根際土壤和根內定殖,但根際土菌量大于根內,且早于根內達到峰值,隨接種時間延長,定殖量下降并維持穩定.田間試驗中,突變菌株B3無論預防還是治療試驗,均能發揮很好的效果,并優于原始菌株和化學農藥雙效靈.[結論]菌株B3能在花椒根際和根內很好地定殖、排擠病原物,具有對花椒根腐病進行生物防治的潛力和良好的發展前景.

【期刊名稱】《西北農林科技大學學報（自然科學版）》

【年(卷),期】2016(044)004

【總頁數】9頁(P114-122) 【關鍵詞】花椒;根腐病;腐皮鐮刀菌;芽孢桿菌;生物防治

【作 者】李姝江;朱天輝;譙天敏;韓珊

【作者單位】四川農業大學林學院,四川成都611130;四川農業大學林學院,四川成都611130;四川農業大學林學院,四川成都611130;四川農業大學林學院,四川成都611130

【正文語種】中 文

【中圖分類】S435.73

花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)屬蕓香科花椒屬植物，是一種重要的油料、香料、藥材等多用途樹種，在中國栽培的范圍廣、產量高[1]，為目前四川省內發展的主要經濟林種之一。但花椒易受到根腐病[2]、流膠病[3]、銹病[4]和枯穗病[5]等20余種病害的危害，其中由腐皮鐮刀菌(Fusarium solani (Mart)

Sacc.)[1-2]引起的花椒根腐病導致根系腐爛，地上部分葉片變小、枝條發育不全，最終導致整株枯死，嚴重影響花椒產量和品質，給花椒產業造成重大的經濟損失。迄今對花椒根腐病病原鑒定及其生物學特性[1]、發生特點[2]及防治[6]研究較為廣泛。蔣其軍等[7]選用根腐凈、福美雙等藥劑對該病進行田間防治，得到較好防效?；瘜W防治雖是一種有效的防治手段，但存在病原菌抗藥性、環境與食品安全、藥害等許多實際問題，一些化學殺菌劑在許多發達國家和地區已嚴格限制使用[8]。而與環境友好的生物農藥越來越受到人們的青睞，是未來農業可持續發展的重要組成部分[9-10]?；ń犯∈且环N土傳根病，侵染循環尚不明顯，發病土壤環境相對穩定，最適宜于生物防治。但目前有關花椒根腐病的生物防治，僅見朱天輝和楊啟智[11]采用腐皮鐮刀菌培養液誘導花椒抗根腐病的初步研究。

芽孢桿菌作為自然界中分布最為廣泛且極易分離培養的一類細菌，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力[12]。目前，在植物病害生物防治領域已得到廣泛應用，如在辣椒[13]、水稻[14]、小麥[15]、煙草[16]等多種植物上顯示出很好的防效，然而有關將花椒根際土壤中的芽孢桿菌應用于根腐病這一經濟林木重大病害防治的研究尚未見報道。此外，成功的生物防治必須具備兩個條件：生防菌能在引進位點有效地定殖，并且能在侵染位點表現出與離體測定時相同的拮抗作用[17]。因此，探索生防菌的定殖動態和消長規律成為生物防治研究的重要內容。本研究以健康花椒根際土中芽孢桿菌為篩選對象，通過初篩、復篩、盆栽試驗獲得目標菌株，經發酵培養后進行定殖動態和田間生物防治研究，以期為開發環保型生防制劑提供技術支撐。

供試花椒樣品為1年生大紅袍花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)苗木，由漢源清溪花椒種植林地提供，用四川于盆栽防效和定殖試驗。

于四川漢源清溪花椒種植林地采集健康花椒根際土壤(表層10 cm以下)裝入無菌樣品袋帶回實驗室，用于芽孢桿菌的分離。

供試盆栽試驗土壤采自四川省雅安市大興鎮林木育種基地，采樣深度為0～30 cm，紫色土。土壤理化性質為：pH 7.1，全磷含量1.8 g/kg，全鉀含量8.4 g/kg，全氮含量1.2 g/kg，速效磷含量25.32 mg/kg，速效鉀含量35.36 mg/kg，堿解氮含量31.56 mg/kg，有機質含量24.3 g/kg。樣土混合均勻后，裝袋(5 kg/袋)，共計140袋，用體積分數0.1%甲醛溶液熏蒸滅菌。

供試病原菌為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani (Mart) Sacc.)，分離于四川漢源清溪花椒根腐病發病林地中發病花椒的根莖組織，由四川農業大學森林保護省級重點實驗室提供。將該菌于25 ℃培養7～10 d后，收集其分生孢子，用無菌水稀釋成105 CFU/mL，用于盆栽防效和定殖試驗。

抗生素為純度99.9%鏈霉素(streptomycin，Str)，購自上海生物工程有限公司。殺菌劑為20%雙效靈，購自四川瑞進特科技有限公司。

采用稀釋平板涂布法[18]。稱10 g采集的根際土壤樣品于盛有90 mL無菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分混勻后制成土壤懸浮液，100 ℃水浴加熱5 min。冷卻后，無菌條件下取1 mL加入裝有9 mL無菌水的試管中，充分混勻得到10-2的稀釋液，按照此法依次稀釋，分別獲得10-3，10-4，10-5和10-6的稀釋液，分別取各濃度土壤稀釋液0.1 mL，將其涂布在LB培養基上，倒置在30 ℃恒溫培養箱中，48 h后根據菌落形態特征，挑取單菌落進行平板劃線，保存于斜面備用。

初篩：將斜面培養的產孢的腐皮鐮刀菌用無菌水洗出分生孢子，用移液槍取1 mL加入無菌培養皿中，倒入45 ℃左右的PDA培養基15 mL，充分混合均勻，冷卻后制成含菌平板。采用點菌法[19]，接種分離獲得的芽孢桿菌，倒置在30 ℃培養箱中，24 h后觀察有無抑菌圈產生。

復篩：將初篩篩選出的抑菌活性較強的芽孢桿菌菌株活化后分別接種于LB肉湯培養液中，30 ℃、120 r/min的搖床中培養24 h后，作為種子液以1∶1體積比加入含有葡萄糖的LB肉湯培養基，30 ℃、120 r/min的恒溫搖床中培養48 h后取出，取上清液，3 500 r/min離心5 min，再取上清液用打孔法[20]進行抑菌試驗，24 h后觀察有無抑菌圈產生。

對篩選出的芽孢桿菌發酵液進行121 ℃、15 min高溫處理，按照上述方法檢測拮抗活性的有無。

根據菌體和菌落形態特征、革蘭氏染色等，結合生理生化試驗，參照《常見細菌系統鑒定手冊》[21]進行鑒定。

取105 CFU/mL的腐皮鐮刀菌分生孢子懸液50 mL，接種于1年生盆栽花椒苗木根系，7 d后用篩選出的生防菌采用1.3節中的方法發酵后，取其發酵液，分不同濃度(原液及稀釋50倍、100倍、200倍、500倍、1 000倍)，采用灌根法[22]對花椒苗進行處理，每盆50 mL，并以無菌水和無菌培養液為對照，每處理10盆，30 d后進行病害調查統計，并計算發病率、病情指數和防治效果。病害分級標準：0級，根部健康；Ⅰ級，1/5以下側根腐爛；Ⅱ級，1/5至1/3側根腐爛；Ⅲ級，1/3至2/3側根腐爛；Ⅳ級，2/3以上側根腐爛甚至整株死亡。

發病率=(發病株數/總接種株數)×100%；

病情指數=[(各病級株數×代表級值)/(總株數×發病最高級的代表級值)]×100；

防治效果=[(對照病情指數-處理病情指數)/對照病情指數]×100%。

原始菌株與突變菌株活化后，與病原菌對峙培養，30 ℃培養5 d，觀察培養皿中有無拮抗帶，記錄拮抗帶的寬度并計算抑制率，每處理重復3次。抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

參照周林等[23]的方法，將突變菌株在抗性平板上繼代培養，每隔3 d轉接1次，轉20次后保存LB斜面，30 d后將保存于斜面的菌株分別轉接于LB平板(含300

μg/mL鏈霉素)和LB培養液。觀察LB平板上突變菌株的生長情況；LB培養液中的突變菌株培養24 h后，涂布于LB平板，然后用滅菌牙簽隨機挑取100個菌落點接種到含300 μg/mL鏈霉素的LB平板上，30 ℃培養3 d，以突變菌株所占百分比計算其穩定性。

田間防治試驗在四川漢源清溪花椒種植林地進行。

預防處理方法為：選擇1年生尚未發病花椒林地內的花椒苗木，用1.3節制作的原始菌株和1.6.1中篩選的突變菌株菌劑原液及二者的10倍、100倍、500倍、1

000倍稀釋液灌根，每株100 mL，每處理30株，每年春季施用1次， 2011-2013年連續3年施用，以雙效靈1 000倍液、無菌水和無菌培養液為對照。

治療處理方法為：選擇3年生發病花椒林地內的花椒植株，用1.3節制作的原始菌株及1.6.1中篩選的突變菌株菌劑原液和10倍、100倍、500倍、1 000倍稀釋液灌根，每株100 mL，每處理30株，春、夏各1次， 2011-2013年連續3年施用，以雙效靈1 000倍液、無菌水和無菌培養液為對照。

以上處理全部完成后80 d進行病害調查，分級標準為：0級，整株健康；1級，葉片變小、枝條發育不全；2級，整株死亡。按1.5節的方法計算發病率、病情指數和防治效果。

試驗數據采用Excel 2007和SPSS 13.0軟件分析處理，采用LSD法進行多重比較(P<0.05)。

根據菌落顏色、形態、光學特性以及是否產生色素等特征進行合并后，從花椒根際土壤中共分離獲得20株生防芽孢桿菌(表1)。采用點菌法進行拮抗測定發現，20株芽孢桿菌均有一定的抑菌作用，其中B2、B3和B20 3株芽孢桿菌對花椒根腐病菌具有較強的拮抗作用，抑菌圈直徑均達到10.0 mm以上。B3菌株拮抗作用最強，抑菌圈直徑均達到20.0 mm以上，其次是B2和B20，抑菌圈直徑均達到13.0 mm以上，顯著高于其他菌株。B11抑菌圈直徑最小，僅為4.0 mm。

采用打孔法進一步復篩，結果表明B2、B20基本不產生抑菌圈，而B3菌株抑菌圈直徑達到26.0 mm，說明B3對腐皮鐮孢病菌具有較好的抑制作用。B3發酵濾液經過121 ℃高溫處理15 min后仍具有拮抗活性(抑菌圈直徑為9.0 mm)，說明B3菌株具有耐熱性。

B3菌株經LB瓊脂平板培養24 h后，菌落扁平，顏色為乳白色，不透明，表面略粗糙，呈白蠟狀，質地軟，略有光澤，無色素，外形不規則近圓形，中部突起，邊緣不整齊。顯微鏡下革蘭氏染色呈陽性，菌體呈桿狀，末端鈍，為短或長鏈，芽孢橢圓中生或近中。B3芽孢桿菌的生理生化特征見表2。表2結果表明，接觸酶、硝酸鹽還原、V-P反應、明膠液化、過氧化氫酶試驗為陽性，苯丙氨酸脫氫酶、甲基紅、馬尿酸鹽水解試驗為陰性，可利用檸檬酸鹽、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，不能利用木糖、甘露醇、阿拉伯糖、乳糖，厭氧、不能形成吲哚，5 ℃生長、50 ℃不生長。根據B3菌株菌落形態特征、革蘭氏染色和生理生化特征測定結果，初步確定B3菌株為蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus Frankland)。

由表3可以看出，接種B3發酵液30 d后，對花椒根腐病具有不同的防治效果，發病率和病情指數隨稀釋倍數的增加而增大，防治效果隨稀釋倍數的增加而降低。其中，無菌水和無菌培養液的對照花椒苗發病率高達94%以上，B3發酵原液至稀釋200倍以下效果顯著，特別是稀釋50倍以下，可基本上控制病害不發生，而稀釋500倍以上防治效果低于50%。

逐步增加鏈霉素質量濃度獲得抗300 μg/mL的突變菌株B3，將原始菌株和突變菌株分別與腐皮鐮刀菌對峙培養5 d后，測量拮抗帶的寬度和病原菌直徑，結果顯示，突變菌株拮抗帶寬度為1.57 cm，抑制率為77.20%；原始菌株拮抗帶寬度為1.59 cm，抑制率為77.87%，二者無顯著差異，說明突變菌株對病原菌仍有較強的抑制作用。

測定結果顯示，繼代培養后突變菌株在含300 μg/mL的LB平板上生長后形態和生長速度與原始菌株相似。選取100個菌落點接種后，突變菌株丟失率為0，說明所獲得的突變菌株B3具有很好的抗藥穩定性。

花椒根際和根內分離的突變菌株數量結果(圖1)表明，根際和根內的定殖量和消長規律有顯著差異，無論在有或沒有腐皮鐮刀菌存在的情況下，突變菌株B3均能在根際和花椒根內定殖。對比根際和根內的定殖量可知，根際土中菌量比根內更早達到峰值，下降維持穩定的菌量要遠大于根內部，說明突變菌株B3更易于在花椒根際土中定殖生長。同時，1～80 d內無菌水處理的花椒根際和根內菌量都要顯著高于病原菌處理。

圖1A顯示，在接種后1～80 d內病原菌處理與無菌水對照在根際的定殖動態變化規律相似，1～5 d內下降，5～10 d上升，10 d時達到最大值，之后下降，40～80 d內維持穩定狀態。其中，10 d時無菌水處理的菌量為6.70×106 CFU/g，顯著高于病原菌處理的菌量(3.32×106 CFU/g)，二者到80 d時仍有9.75×103

CFU/g和4.57×103 CFU/g的菌量。

圖1B顯示，接種后1～20 d內無菌水和病原菌處理花椒根內的菌量呈緩慢上升趨勢，20 d時均達到最大值，分別為4.47×105 CFU/g和1.35×105 CFU/g，之后下降，40～80 d保持穩定，且差異不顯著，80 d時根內仍然能檢測到突變菌株B3，菌量分別為1.61×103 CFU/g和0.80×103 CFU/g。

原始菌株和突變菌株B3對花椒根腐病的田間預防效果見表4。

由表4可以看出，B3原始菌株和突變菌株菌劑原液、50～1 000倍稀釋液沿根系幅面灌根，對花椒根腐病都有一定的預防效果，隨稀釋倍數的增大發病率和病情指數升高，而預防效果變差。無菌水和無菌培養液對根腐病無預防作用，發病率均超過30%。突變菌株原液稀釋500倍以下的預防效果顯著優于雙效靈1 000倍液，而突變菌株1 000倍液與雙效靈1 000倍液相當。相比而言，原始菌株菌劑稀釋200倍以下的預防效果與突變菌株相同，但500倍和1 000倍稀釋液發病率顯著高于突變菌株，相應預防效果也較差；1 000倍稀釋液的預防效果僅為52.34%，而突變菌株菌劑均超過80%。

由表5可以看出，B3原始菌株和突變菌株菌劑原液、50～1 000倍稀釋液沿根系幅面灌根，對花椒根腐病都有一定的治療作用，隨稀釋倍數的增大發病率和病情指數升高，而治療效果變差。突變菌株菌劑稀釋200倍以下的治療效果顯著優于雙效靈1 000倍液，500倍稀釋液與雙效靈1 000倍液差異不顯著，但均超過50%。而原始菌株菌劑稀釋200倍以下治療效果才高于50%，500倍和1 000倍稀釋液的療效顯著低于突變菌株和雙效靈1 000倍液。以上結果說明，在自然條件下，菌株B3對花椒根腐病既能治療又能預防；無論在未發病還是已發病的花椒林地，突變菌株的防治效果均比原始菌株更好，更能適應環境并定殖及繁殖。

眾多研究表明，細菌有著其他微生物所不具備的優點，如種類和數量龐大，繁殖快速，作用方式多樣等，因此在植物病害生物防治中有著非常重要的地位。目前，已發現有18個屬的細菌在植物病害生物防治上具有應用潛力[24]，特別是芽孢桿菌屬(Bucillus)的細菌，由于其抗逆性強、商貯性好，更是受到生防工作者的重視。其中，蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)是土壤中的優勢菌，不僅能防治植物病害，而且還能促進植物生長，屬于目前研究比較多的植物根際促生菌[25]。本研究所分離的蠟樣芽孢桿菌對花椒根腐病菌拮抗作用強，能抗高溫，易繁殖，是一種極具開發價值的生防菌。但劉國紅等[26]指出，芽孢桿菌屬細菌的表型特征范圍較廣泛，較難準確對其進行屬種確定，因而結合張艷東等[27]的報道，還應對所得B3菌株進行16S rDNA鑒定進而印證本研究的菌株分類鑒定結果。

植物根標存在大量的有益微生物，現已從多種植物根際分離到對病害具有良好抑制效果的微生物[28-29]。但是，生防菌在植物根際或根部有效定殖是防治根部病害成功與否的關鍵[17]。將DNA和RNA探針[30]、基因標記[31]、熒光顯微鏡[32]等方法應用于生防微生物在植物根部定殖均已見報道；利用抗生素標記具有經濟、簡便、快速等優點。周林等[23]以鏈霉素標記枯草芽孢桿菌，檢測其在香蕉體內及根際的定殖動態，獲得理想效果。本試驗使用鏈霉素標記也成功獲得蠟樣芽孢桿菌B3抗300 μg/mL鏈霉素的突變菌株，經與原始菌株比較拮抗活性、穩定性發現，其性狀穩定，拮抗活性較優。在定殖和消長動態測定中，B3突變菌株在根際土中定殖量大于根內，且達到峰值的時間早于根內。這與劉慶豐等[33]關于枯草芽孢桿菌在大白菜根圍的定殖結果相似，生防菌從根際土拓展到根系內部是一個漸進的過程，在此過程中可能受到諸多因素影響，如植物與土壤的相互作用、土壤溫度、濕度、植物氣孔開放程度等。此外，本研究結果僅是利用灌根法接種B3突變菌株，結合孫建波等[22]、周林等[23]的報道，說明該菌株可主動穿過根皮層進入花椒體內，顯示出較強的定殖能力。再者，無論環境中有無病原菌存在，該突變菌株均能很好地定殖于花椒的根系和根際土中，有利于其在根部占據有利生態位點，這為抑制花椒根腐病菌奠定了良好的基礎。因此，將定殖能力與拮抗活性相結合，可作為優良高效持久的生防菌篩選的重要指標。

蠟樣芽孢桿菌應用于植物病害生物防治時都要經過發酵使細胞富集，進而可以直接制成活菌制劑，但是在實際應用過程中，菌株效能不穩定是制約其開發的重要條件之一。本研究利用突變菌株進行田間防治試驗，取得了優于原始菌株及化學農藥(雙效靈)的預防和治療效果，結合定殖結果來看，突變菌株B3可能更適應自然環境，能更好地定殖、排擠病原物，其防效更持久、穩定，具有良好的應用前景，可成為防治花椒根腐病的一種新途徑。

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