基因槍的使用

2023年12月14日發(作者：月亮升起來)

外源DNA的準備及微彈載體制備

1.稱取60 mg（或3mg）的金粉（Bio-Rad）置1.5 mL eppdorf管中。

2.加入1 mL（或50ul）的無水乙醇，充分渦旋3-5min， 10000 rpm 離心10s，

使金粉沉淀，棄上清液。

3.加入1ml(或50ul) 無菌水洗，振蕩1min,10000rpm離心10S；

4.棄上清，加入滅菌水1 mL(或50ul），儲存于-20℃待用。

5.取50 μL制備好并已渦旋的金屬顆?；旌弦河?.5 mL離心管中。依次加入

5-8μL DNA(1 μg/μL)、50 μL CaCl2(2.5 mol/L)、20 μL 0.1 mol/L的亞精胺（現

配現用），每加完一樣可震蕩2-3s。

6.振蕩3min，冰上靜置10min(有的室溫)，10000rpm離心10-20秒，棄上清。

7.加200ul 乙醇，振蕩重懸，10000rpm，離心1min，棄上清。乙醇洗2-3次。

8.再將顆粒懸浮于30-15ul乙醇中，用槍吸打混勻。置于冰上。

9.取5-10ul懸浮均勻的鎢粉置于micro carrier上（flying disks）。注意：確定顆粒懸浮充分，且棄去最后的有大團塊。

洋蔥表皮細胞的準備

平板（可以加一些抗生素如100mg/L Amp）

2.較新鮮、分層較好的洋蔥

3.刀片、鑷子、刀（70%酒精消毒或滅菌）

方法：將洋蔥切成西瓜片狀，選擇內層較為平整的莖片，用鑷子剝取內表皮細胞層，翻轉，光面向下，平鋪在MS平板上，預培養4h待用 (注意：一般選擇洋蔥中心以外3、6層，莖片不要太老，也不能太嫩，盡量不要帶葉肉細胞，鋪時盡量不要有氣泡)，鋪于平板中心直徑約2cm即可( 培養皿托盤中心圓大小，中間盡量鋪滿，顆?；炯写蛟谥虚g部位)。

基因槍法(particle bombardment)轉化洋蔥表皮

1.待micro carrier上的顆粒干后，可裝載基因槍的載盤上，注意DNA面向下，以便發射于鋪有洋蔥表皮的MS平板上。(可裂膜1100-1300Pa）。 2.利用Biorad公司的PDS-1000基因槍將附有質粒DNA的鎢粉轟擊進入洋蔥表皮。轟擊操作：

①將鋼瓶上閥門打開，調整壓力表前黑色旋鈕至適當壓力（至少較所需壓力高200psi）(一般打洋蔥表皮選用1100psi，所以鋼瓶壓力選擇1500psi左右）。

②放置儀器的超凈臺提前開紫外消毒。用75%的酒精擦拭chamber 四壁及其內物件。Micro carrier 、可裂膜、鋼絲網提前泡在75%的酒精中消毒。用前，置于干凈無菌的平皿中吹干。

③組裝：將鋼絲網和可裂膜依次裝在chamber頂部的旋鈕中，其下層的裝置中放入涂有鎢粉且已干燥的macro carrier, DNA 面向下。打開封蓋的平皿放在下層的托盤上。關上壁門。（可調整sample 與micro carrier 之間的距離，洋蔥表皮至可裂膜的距離6-9cm）。

④抽真空至所需真空度（一般為26-28），轟擊。

⑤待chamber恢復壓力，取出sample及所有零件。

⑥重復步驟3-5，直到所有試驗材料轟擊完畢。

使用完畢后，關上鋼瓶閥門，抽真空，轟擊至鋼瓶上壓力表降至零，回復chamber壓力后即可關閉電源。將壓力表前黑色旋鈕逆時針方向旋松。

3.將plate封好(parafilm), 22℃暗培養24~48小時后,在熒光顯微鏡下觀察,將洋蔥表皮切成適當大小置于載玻片上先滴一滴水,然后將蓋玻片蓋好,注意不要有氣泡.然后置于顯微鏡下觀察拍照,確定外源融合蛋白在細胞內的位置拍照。