脂肪酶的概述和應用

2023年12月4日發(作者：龜茲樂)

脂肪酶的概述與應用

一脂肪酶概述、

脂肪酶（Lipa，甘油酯水解酶）隸屬于羧基酯水解酶類，能夠逐步的將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶存在于含有脂肪的動、植物和微生物（如霉菌、細菌等）組織中。包括磷酸酯酶、固醇酶和羧酸酯酶。脂肪酸廣泛的應用于食品、藥品、皮革、日用化工等方面脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當油料種子發芽時，脂肪酶能與其他的酶協同發揮作用催化分解油脂類物質生成糖類，提供種子生根發芽所必需的養料和能量；動物體內含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補充胰脂肪酶對脂肪消化的不足，在肉食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。

脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉酯化及酯類的逆向合成反應，除此之外還表現出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（Hara；Schmid）。脂肪酶不同活性的發揮依賴于反應體系的特點，如在油水界面促進酯水解，而在有機相中可以酶促合成和酯交換。

脂肪酶的性質研究主要包括最適溫度與pH、溫度與pH穩定性、底物特異性等幾個方面。迄今，已分離、純化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性質，它們在分子量、最適pH、最適溫度、pH和熱穩定性、等電點和其他生化性質方面存在不同（Veeraragavan等）?？傮w而言，微生物脂肪酶具有比動植物脂肪酶更廣的作用pH、作用溫度范圍，高穩定性和活性，對底物有特異性（Schmid等；Kazlauskas等）。

脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda和Desnnelv就發現了這一現象。溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反應是在2個彼此分離的完全不同的相的界面上進行。這是脂肪酶區別于酯酶的一個特征。酯酶（E C3.1.1.1）作用的底物是水溶性的，并且其最適底物是由短鏈脂肪酸（≤C8）形成的酯。

脂肪酶是重要的工業酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應，廣泛應用于油脂加工、食品、醫藥、日化等工業。不同來源的脂肪酶具有不同的催化特點和催化活力。其中用于有機相合成的具有轉酯化或酯化功能的脂肪酶的規?；a對于酶催化合成精細化學品和手性化合物有重要意義。

脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶，它可作用于甘油三酯的酯鍵，使甘油三酯降解為甘油二酯、單甘油酯、甘油和脂肪酸。

酶是一種活性蛋白質。因此，一切對蛋白質活性有影響的因素都影響酶的活性。酶與底物作用的活性，受溫度、pH值、酶液濃度、底物濃度、酶的激活劑或抑制劑等許多因素的影響。

脂肪酶在微生物中有廣泛的分布，其產生菌主要是霉菌和細菌。已經公布的適用于甘油三酯加工的不同來源的脂肪酶有33種，其中18種來自霉菌，7種來自細菌。

脂肪酶可將甘油酯（油、脂）水解，在不同階段可釋放出脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯及甘油。水解生成的脂肪酸，可以用標準的堿溶液滴定，以滴定值表示酶活力。

二脂肪酶的結構解析

1、 分子結構

研究表明, 來源不同的脂肪酶 ,其氨基酸組成數目從 270 ～ 641 不等 , 其分子量為29 000～ 100 000。迄今為止 ,人們已經對多種脂肪酶進行克隆和表達 ,

并利用 X-衍射等手段和定向修飾等技術測定了酶的氨基酸組成、晶體結構 、等電點等參數, 確定了組成脂肪酶活性中心的三元組(triad)結構 。表1列出了幾種常見的脂肪酶的結構特征參數。正如下表所示, 多數酶都有變種(如 CCL(A)和CCL(B)、GCL Ⅰ和 GCL Ⅱ等),不過這些不同變種的酶具有絕大多數相同的氨基酸序列, 其氨基酸組成數目完全相同, 不同的只是個別氨基酸的差異 。一般而言, 不僅構成活性中心的三元組氨基酸種類相同 , 而且位置不變;其分子量和等電點略有不同。

2、 脂肪酶催化中心三元組

研究表明，盡管不同來源的脂肪酶有不同的氨基酸組成(殘基數目、分子量 、三維空間結構等),但由于生物的同源性和進化過程的保守性 ,其催化中心擁有相似

或相同的特征區 His-X-Y-Gly-Z-Ser-W-Gly或 Y-Gly-His-Ser-W-Gly(W 、X、Y、Z 指非特異性氨基酸)。如圖1所示，絕大多數脂肪酶的活性中心都由 Ser

和 His 參與組成, His、Ser與另一種氨基酸殘基(如 CCL 和 GCL的Glu、RML

和 hPL 的 Asp 等)一起構成脂肪酶催化活性中心的三元組(triad)。如圖 2 所示

3、 立體結構

具體參數方法：

三．脂肪酶的純化與表達

? pPIC9k- mRCL 表達質粒的構建

1.以華根霉基因組DNA為模板使用PCR方法擴增RCL（華根霉脂肪酶全基因）成熟肽，擴增的基因片段純化后克隆到載體

pMD19-T Vector 中，轉化5α及進行重組質粒的篩選，由此構建重組質粒 pMD19-mRCL 。

2.由質粒 pMD19-mRCL切下目的基因片段，連入表達載體

pPIC9k 構建表達質粒 pPIC9k-mRCL 。

（1）質粒雙酶切

克隆的質粒 pMD19-mRCL 和酵母表達質粒 pPIC9k 分別被

AvrⅡ和Not I 雙酶切，得到pMD19-mRCL質粒雙酶切的 800bb 左右的小片段以及 pPIC9k 質粒的雙酶切線性質粒大片段，回收目的條帶。

（2）連接

載體 DNA 與目的 DNA 片段混合連接。

（3）轉化 5α 及重組質粒的篩選

重組質粒pPIC9K-mRCL的構建

? 重組蛋白在巴斯德畢赤酵母 GS115 中的初步表達

1.巴斯德畢赤酵母感受態細胞的制備

2.巴斯德畢赤酵母的電轉化

對質粒線性化，回收酶切產物；再與巴斯德畢赤酵母感受態細胞混勻，電轉化得到含目的基因的重組巴斯德畢赤酵母

3.重組巴斯德畢赤酵母的鑒定

可用濃度梯度進行抗性篩選

4.巴斯德畢赤酵母表達脂肪酶

甲醇誘導重組蛋白的表達

巴斯德畢赤酵母表達系統的優點（選擇的原因）：

1.畢赤酵母是需氧酵母菌，在有氧條件下能高密度生長，因此有利于擴大生產獲得高濃度細胞，從而進行高效表達

2、通過質粒整合到畢赤酵母基因組的外源基因結構穩定，不易丟失；且外源基因能以高拷貝數整合到畢赤酵母基因組中，能夠篩選到高表達菌株

3、畢赤酵母甲醇氧化酶(alcohol oxida，AOX)基因的強啟動子特別適用于外源基因的調控表達

4、畢赤酵母自身分泌到培養基中蛋白很少，使得分泌性的外源蛋白容易從培養基的基質中分離

5、畢赤酵母對外源蛋白產物進行N一乙酰糖基化修飾的結構為高甘露糖型，糖鏈平均為8～14個甘露糖基，更接近于高等生物，且聚糖末端不含 1，3連接的甘露糖殘基(有強的免疫原性)，因而適用于臨床應用

6、使用方便、簡單，而且成本較低

4.表達后的純化步驟：

? 對象:重組巴斯德畢赤酵母

? 過程：

1.搖瓶甲醇誘導培養

2.脂肪酶的分離純化

（1）10 KD 超濾膜濃縮

將mRCL發酵液離心后棄掉沉淀，上清液用微孔濾膜過濾，微濾后的溶液用10 KD 超濾膜濃縮。濃縮酶液用緩沖液透析過夜。

（2）強陽離子交換柱層析

將透析液上樣到已用上述緩沖液預平衡的強陽離子交換柱層析（Ф1.6cm×20cm），用相同緩沖洗脫未吸附蛋白。后用NaCl濃度梯度緩沖液階段洗脫吸附蛋白，一定的洗脫速率和時間分部收集，集中脂肪酶活性組分，用緩沖液透析。

3）疏水色譜柱層析

將透析后的酶液繼續用疏水柱層析(Ф1.6 cm×20 cm)層析，用相同緩沖液洗脫除去未吸附蛋白。然后用硫酸銨濃度梯度差緩沖液階段洗脫吸附蛋白，最后用 H2O 洗脫，一定的洗脫速率和時間分部收集，集中脂肪酶活性組分，透析除鹽。

4）得到脂肪酶活性組分mRCL

四．脂肪酶的化學修飾

設計思路

脂肪酶作為一種水解酶，不僅催化水解反應而 且催化有機相中酯合成和酯交換反應。有機相酶催 化技術自 20 世紀 80 年代開創以來，已獲得了巨大 的發展，廣泛應用于食品、醫藥、化妝品等行業。 近幾年來人們為了提高酶在有機相中的溶解性及穩 定性，在酶的化學手段修飾和生物學手段修飾方面 開展了許多工作[1－6]。而化學修飾是提高和改變酶

催化性能的有效方法。Basri 等[7]用氨基酯的鹽酸鹽 對脂肪酶進行化學修飾，發現修飾酶在有機溶劑中的溶解度、熱穩定性和催化酯化反應活性都有很大 提高。Tatsuo Maruyama

等[8]用硬脂酸修飾了脂肪 酶，發現雖然水解活性下降，但酯化活性明顯提高。

從文獻來看，就化學修飾改善酶催化功能方面而言，以前主要研究了修飾酶在有機相（均相）中的穩定性、催化活性等問題，而涉及非均相界面催化的研 究甚少。表面活性劑是一類兼具親油基和親水基的兩 親物質，它能富集于界面從而顯著地改變界面性質。

修飾原理

當水溶性的酶分子中引入長鏈烷基后，便具有了類似 于表面活性劑的兩親結構。因此與未經修飾的酶相 比，修飾后的酶疏水性增強，界面活性提高，從而有 利于在有機相或界面催化化學反應，這對于酶的實 際應用具有重要意義。本文從界面化學的角度對用 N-羥基琥珀酰亞胺活化的硬脂酸修飾的 Lipola 脂 肪酶的界面化學性質進行了研究，重點考察了修飾酶 降低表/界面張力的能力及界面催化活性。

1.1 化學試劑及儀器

化學試劑：Lipola 100L，諾維信（中國）生物技術有限公司生產；N-羥基琥珀酰亞胺，為生化試劑；硬脂酸及其他試劑，為國產分析純試劑，購自中國醫藥（集團）上海化學試劑公司。

儀器：冷凍干燥儀（7934001 8917z-01，USA），紫外可見分光光度計(UVIKON，Germany)，元素分析儀（Vario EL，Germany），表面張力儀（DCA315，USA)，界面張力儀（DVT30，Germany）及 LB 成膜裝置 LB5000（KSV5000，Finland)。

1

實驗材料與方法

1.2 硬脂酸琥珀酰亞胺酯的制備

活化后的硬脂酸易于與酶表面的氨基反應，因此先將硬脂酸活化。將硬脂酸溶入適量

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并加入一定比例的

N-羥基琥珀酰亞胺和二環己基碳酰亞胺。三者摩爾比為1∶2.25∶2.25[9－10]。磁力攪拌反應 8 h，反應溫度為 30 ℃。反應結束后過濾，濾液用乙醚萃取。蒸

1.3 Lipola脂肪酶的化學修飾

在磁力攪拌下，將 Lipola 100 L 用透析袋于去離子水中透析 2 天，冷凍干燥得到白色固體酶晶體。固體酶置于 5 ℃冰箱中儲存備用。300 mg 固體酶溶于 20 mL 磷酸二氫鉀–硼砂緩沖液（pH=7.4），將 200 mg 硬脂酸琥珀酰亞胺酯溶于 5 mL DMF 后逐滴加入酶溶液。10 ℃下反應 10 h。反應完畢后，混合物在 4 000 r/min 下離心 15 min 除去未反應的酯，重復操作兩次。上清液用透析袋于去離子水中透析一周后冷凍干燥，干燥后的產物即為修飾酶。

1.4 ：修飾度的測定

由于在 Lipola 表面引入烷基，所以修飾酶中酶含量降低，而酶中含氮量固定，故修飾后總含氮量降低。測定酶修飾前后的含氮量，其差值相對含量定義為修飾度。酶的平均含氮量由元素分析儀測定。實驗測得未修飾酶的平均含氮量為 14.2%。

1.5 Lipola脂肪酶酶活測定

去乙醚得到白色固體，然后用無水乙醇反復洗滌后經真空干燥即得。

水解活力采用橄欖油乳化液法測定[11－12]；酯化活力按 M. Basri 等的方法進行。

[13]界面水解活力的測定按如下方法進行：在 50mL 錐形瓶中加入 10 mL 一定濃度的酶溶液（濃度：

0.1～1 g/L），37 ℃預熱 5 min，再加入 2 mL 橄欖

油，低速磁力攪拌，橄欖油在 Lipola 的催化下在界面水解。生成的脂肪酸的量采用酸堿滴定法測定。

1.6 Lipola脂肪酶水溶液的表/界面張力測定

Lipola脂肪酶水溶液的表面張力采用吊片法測定。正己烷-酶水溶液體系的界面張力采用滴體積法測定。

1.7

Lipola脂肪酶 LB 膜的制備

選擇水–異丙醇-氯仿為鋪展劑[16－18][15][14]，三者體積比為 5∶6∶1。亞相為用超純水配制的 5% KCl 鹽溶液。用微量注射器將酶溶液鋪展于亞相表面，待溶劑揮發 30 min 后用 LB

成膜裝置壓膜，壓膜速率為 3cm/min，同時得到∏-A 曲線。

2

結果與討論

2.1 Lipola脂肪酶的水解活性

圖 1 為溫度對Lipola催化橄欖油水解酶活的影響。由圖 1 知，Lipola最適水解溫度約為 37 ℃，

雖然修飾后水解酶活有所降低，但并不改變

Lipola的最佳水解溫度，這與文獻報道一致。相同溫度下的酶活隨修飾度的增加而下降。修飾酶中酶的質量分數下降、修飾過程中酶的活力損失等均可能是水解酶活降低的原因之一；由于硬脂酸的引

入使得 Lipola酶活部位的空間結構發生變化也可能導致 Lipola 失活。

[8]五．脂肪酶的應用

1、酶在食品工業

酶在食品工業中具有廣泛而重要的作用, 近年來人們對脂肪酶的研究取得了很大的進展, 已引起了全世界的廣泛關注。目前,脂肪酶在非水體系中反應的研究在國外已取得突破性進展, 脂肪酶的應用已深入到食品工業中的多個領域, 國內脂肪酶在非水介質中的酶促反應亦成為近幾年的研究熱點, 并取得一些可喜的成果。當前, 由于固定化酶的方法過于復雜, 效率低、成本高, 或使用了有毒的化

學試劑而不符合食品加工所必須滿足的經濟和安全的標準, 所有這些都限制了固定化脂肪酶技術在食品工業中的應用, 但隨著生物技術以及材料、化工等各相關學科的發展, 相信固定化脂肪酶的工作會有新的突破。在食品中也將得到更廣泛的運用, 對促進食品工業快速發展具有重要意義

⑴ 脂肪酶在焙烤食品中的應用

隨著焙烤食品工業的快速發展, 消費者的食品安全和健康意識日益增強, 對面粉及其制品提出了愈來愈高的要求。要想生產出好的面粉, 就需要優質的原料, 而我國小麥由于品質參差不齊, 要想達到焙烤食品工業的要求, 就要在面粉后處理中添加食品添加劑, 來彌補面粉品質的不足。過去面包粉改良主要是化學改良劑,

如溴酸鉀, 雖然它對面團及面包有較好的作用, 但長期使用對人體有害, 2005 年

7 月 1日被我國禁止使用。

隨著溴酸鉀被禁用, 如何使用天然無害具有替代功能的產品, 成為廣大焙烤食品及面粉企業關注的焦點, 而生物酶制劑滿足了這方面的要求。酶作為一種生物制品, 在面粉改良中, 具有顯著的優越性:酶本身就是活細胞產生的活性蛋白質, 不會留下有毒的物質; 酶的催化作用具有高度的專一性, 一種酶只對一種底物起作用, 如淀粉酶只能催化淀粉的水解, 而對蛋白質則無效。酶的催化效率非常高,

比一般催化劑高 107~1 013 倍, 因此用量相當少; 酶的操作條件溫和, 在常溫、常壓下就能進行。脂肪酶是酶制劑的一種, 酶的所有特性它都具有, 與其它酶制劑如葡萄糖氧化酶復配后能夠取代化學增筋劑溴酸鉀。它能夠提高面制品的烘焙品質、改善面包質地、延長制品的貨架期。脂肪酶能催化甘油三酯水解生成甘油二酯, 甘油一酯或甘油。它對面團有強筋作用, 能夠提高面包的入爐急脹, 增大面包體積, 且對面包芯有二次增白作用。它符合了焙烤食品工業綠色、安全、健康的發展要求, 正愈來愈受到廣大焙烤食品及面粉企業的歡迎, 相信它在這些領域的應用具有更加廣闊的前景。

⑵脂肪酶在乳品工業中的應用

應用于乳酯水解, 包括奶酪和奶粉風味的增強、奶酪的熟化、代用奶制品的生產、奶油及冰淇淋的酯解改性等。

脂肪酶作用于乳酯并產生脂肪酸, 能賦予奶制品獨特的風味。脂肪酶釋放的短碳

鏈脂肪酸(C4- C6 ) 使產品具有一種獨特強烈的奶風味, 而釋放的中碳脂肪酸

(C10- C14) 使產品具有皂似的風味。同時, 由于脂肪酸參與到類似微生物反應的過程中, 增加了一些新風味物質的形成, 如甲基酮類、風味酯類和乳酯類等。傳統奶酪制品加工所用的脂肪酶大都來自動物組織, 如豬、牛的胰腺和年幼反芻動物的消化道組織,不同來源的脂肪酶會產生不同風味特征。脂肪酶還可使用在羊奶仿制牛奶的制品中。對不同奶源的奶制品 , 脂肪酶的使用可大大改善其有的不良風味 , 促使新的風味的產生, 并能改進乳制品的營養價值。脂肪酶在生產酶改性奶酪制品中關鍵作用, 酶改性奶酪中含有的游離脂肪酸比只經過普通處理的奶酪中要高 10 倍以上, 這對于其作為風味增強劑是十分有利的。

2、在醫藥領域中

在醫藥領域中，脂肪酶是非常重要的藥物作用靶點或標記物，同時也可以用來生產多不飽和脂肪酸等多種醫藥中間體;

3、洗滌劑

同時隨著環境保護的意識越來越強，生產易于被生物降解的無污染洗滌劑已經是現代洗滌劑發展的方向，而將脂肪酶加入洗滌劑中可大大提高其去污效果，并且脂肪酶是生物產品，易被降解，不污染環境;在皮革加工過程中需要把皮毛上脂肪去除。以前主要是用石灰掩埋去除，但效果不明顯，現在利用脂肪酶的特性將依附脂肪分解成易于祛除的脂肪酸和甘油。用酶對各種動物皮毛進行處理，其脫脂效果明顯，可提高皮革質量;另外，脂肪酶還被用于造紙工業，主要是利用脂肪酶除去造紙出現的洽脂。生物柴油是生物質能的一種形式，生物酶法生產生物柴油是通過脂肪酶進行酯化反應，制備相應的脂肪酸酯。酶催化法對原料沒有特殊要求，可以廢油脂、高酸油脂等為原料進行生產，且產物提取簡單、反應條件溫和、醇用量小、甘油易回收和無廢物產生，在此過程還能合成一些高價值的產品，增加經濟效益。