槲皮素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用的研究

2024年4月2日發(fā)(作者：家庭聚會)

槲皮素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用的研究

洪志偉;孟令宇;葛雅琨;張元新

【摘 要】槲皮素是普遍存在于植食性植物中的一類黃酮類化合物,具有明顯的抗氧

化、抗炎、保肝、抗腫瘤、抑菌等多種生物學(xué)功能特性.通過SDA-PAGE和堿性磷

酸酶實驗分析槲皮素作用前后的菌體蛋白質(zhì)及堿性磷酸酶的變化,研究其對金黃色

葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果.研究結(jié)果表明,槲皮素是通過破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、抑

制菌體對蛋白質(zhì)的利用,導(dǎo)致細(xì)菌正常生理功能的喪失或減退,達(dá)到抑菌的目

的.%Quercetin,a kind of flavonolignans found in phytophagous plants,has

obvious biological function,such as antioxidant,anti-inflammatory,anti-

tumor and bacteriostatic SDS-PAGE and alkaline

phosphata assay,we analyze the change of protein and activity of

alkaline phosphata after quercetin treatment of Escherichia coli and

Staphylococcus results show that quercetin inhibit the growth

and protein utilization of the Escherichia coli through the disruption of cell

wall and the loss of physiological function of bacterium.

【期刊名稱】《吉林化工學(xué)院學(xué)報》

【年(卷),期】2017(034)005

【總頁數(shù)】4頁(P38-41)

【關(guān)鍵詞】槲皮素;抑菌作用;金黃色葡萄球菌;大腸桿菌

【作 者】洪志偉;孟令宇;葛雅琨;張元新

【作者單位】吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,吉林 吉林 132022;吉林化工學(xué)院

生物與食品工程學(xué)院,吉林 吉林 132022;吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,吉林

吉林 132022;吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,吉林 吉林 132022

【正文語種】中 文

【中圖分類】O501

槲皮素(Quercetin)作為普遍存在于生菜、洋蔥、茶葉、卷心菜、西蘭花、蕎麥、

豆類、蘋果、等人類食用性植物中的重要生物黃酮化合物，具有多種生物學(xué)功能與

活性.在銀杏葉、桑寄生等中草藥中是是多酚物質(zhì)中重要的抗氧化劑之一[1-3].槲皮

素的可能作用機(jī)制有：增強(qiáng)抗氧化酶活性，降低谷胱甘肽的耗竭，抑制脂質(zhì)過氧化

而提升原代肝細(xì)胞抗酒精性氧化損傷能力，保護(hù)作用呈劑量與時間效應(yīng)關(guān)系[4].趙

麗婷等[5]的研究表明飼料中添加槲皮素后，動物外周血的抗氧化能力明顯增強(qiáng)，

而且還有保護(hù)和節(jié)約維生素C、維生素E的作用，表明小腸上皮細(xì)胞吸收后的槲皮

素以直接或間接的方式發(fā)揮了抗氧化作用.大量的研究也表明，槲皮素可以影響腫

瘤基因的正常表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖；降低細(xì)胞內(nèi)某些酶類的活性，蛋白質(zhì)分子的

降解，最終誘導(dǎo)細(xì)胞裂解、腫瘤細(xì)胞凋亡.除此之外，槲皮素還具有抗病毒、抗菌、

抗炎、保肝等多種生理生化功能[6-8].

由于槲皮素分布廣泛、生物學(xué)作用多樣，近年來受到學(xué)術(shù)界廣泛關(guān)注，成為各領(lǐng)域

的研究熱點.尤其是槲皮素通過損傷細(xì)胞壁、阻礙蛋白質(zhì)/核酸合成、作為代謝拮抗

物等機(jī)制所展現(xiàn)出的抗菌潛力，為解決臨床多藥耐藥現(xiàn)象提供了新思路.而且，近

年來對黃酮類化合物的各種研究成果，如抑菌、抗炎、抗氧化、抗?jié)兊茸饔帽粡V

泛應(yīng)用到臨床醫(yī)藥及食品行業(yè)[9,10].因此，研究槲皮素對金黃色葡萄球菌、大腸桿

菌等疾病和環(huán)境污染微生物的作用機(jī)制，將對臨床應(yīng)用具有重要的理論和實踐指導(dǎo)

意義.

1.1 試劑與儀器

試劑：槲皮素(Quercetin)，Sigma-Aldrich.儀器：DHG-9240(A)酶標(biāo)儀，

BILON96-II細(xì)胞破碎儀，MP-8050電泳儀.菌種：金黃色葡萄球菌

(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)購買于中國普通微生物學(xué)

菌種保藏管理中心.

1.2 實驗過程

1.2.1 槲皮素的抑菌實驗(濾紙片藥敏法)

用直徑為6 mm的打孔器制作圓形濾紙片，并將其分裝到小離心管中，進(jìn)行高壓

滅菌(121 ℃，15 min)，烘干備用.在無菌操作臺中，將濾紙片浸于一定濃度的槲

皮素藥劑中，浸漬一段時間后取出，風(fēng)干，備用.

取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，2 000 rpm離心2 min，使細(xì)菌聚集在離心管底部，移

走上清800 μL，剩余200 μL，用移液器重懸菌體，用涂布棒均勻的涂布在含瓊脂

粉的固體培養(yǎng)基上，分別涂布兩塊平板；平板靜置3～5 min，在無菌條件下將藥

敏濾紙片貼于平板表面，輕壓一下，使濾紙片貼平；37 ℃條件下培養(yǎng)16～18 h，

測量其抑菌圈的直徑，在兩個不同方向各測量2次，最后取其平均值[11].抑菌效

果等級按如下標(biāo)準(zhǔn)劃分[12]：D抑菌直徑<8 mm為無抑菌作用，用“-”表示；8

為中等抑菌作用，用“++”表示； D抑菌直徑>16 mm以上為強(qiáng)抑菌作用，用

“+++”表示.

1.2.2 槲皮素對供試菌生長的影響

對照組生長曲線：將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌稀釋至5×105 cfu/mL后培養(yǎng)，

間隔2 h取樣，在595 nm處用紫外分光光度計在測OD值，記錄數(shù)據(jù).

樣品組生長曲線：將對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌或大腸桿菌接種到含有不同濃度

槲皮素的LB液體培養(yǎng)基中，細(xì)菌終濃度為107 cfu/mL，恒溫?fù)u床培養(yǎng)(37 ℃，

150 rpm)8 h后，超聲波破碎細(xì)胞(500 w，工作5 s，間隔5 s，超聲10 min).12

000 rpm，4 ℃離心10 min，收集上清.將上清與上樣緩沖液混合后，100 ℃煮沸

5 min，冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE電泳.同等條件培養(yǎng)的不含槲皮素的金黃色葡萄球

菌或大腸桿菌做對照組.

1.2.3 槲皮素對供試菌蛋白利用的影響

將對數(shù)生長期的金黃色葡萄球菌或大腸桿菌接種到含有不同濃度槲皮素的LB液體

培養(yǎng)基中，細(xì)菌終濃度為107 cfu/mL，恒溫?fù)u床培養(yǎng)(37 ℃，150 rpm)8 h后，

超聲波破碎細(xì)胞(500 w，工作5 s，間隔5 s，超聲10 min).12 000 rpm，4 ℃離

心10 min，收集上清.將上清與上樣緩沖液混合后，100 ℃煮沸5 min，冷卻后進(jìn)

行SDS-PAGE電泳.同等條件培養(yǎng)的不含槲皮素的金黃色葡萄球菌或大腸桿菌做對

照組.

1.2.4 堿性磷酸酶活性實驗

將供試菌接種于液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜，收集菌體，以含不同濃度的

槲皮素的培養(yǎng)基重懸菌體，是菌體中濃度為105 cfu/mL.同時設(shè)置空白對照.分別

在1、3、6、9 h取樣，4 000 rpm離心10 min，取上清檢測堿性磷酸酶的活性.

2.1 槲皮素的抑菌實驗

表1的實驗結(jié)果表明，槲皮素以濃度依賴的方式對大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，隨著

濃度的增加，抑菌效果逐漸增強(qiáng)；當(dāng)其濃度達(dá)到100 μM時，其抑菌圈直徑為

9.7±0.2 mm，抑制強(qiáng)度為弱；當(dāng)其濃度達(dá)到200 μM時，其抑菌圈直徑為

14.5±0.3 mm，抑制強(qiáng)度為中等；當(dāng)其濃度達(dá)到400 μM以上時，其抑菌圈直徑

大于16.9±0.2 mm，抑制效果為強(qiáng)；而槲皮素對金黃色葡萄球菌的抑菌效果較弱，

只有濃度達(dá)到800 μM時，其抑菌圈直徑才達(dá)到9.1±0.4 mm，僅有微弱的抑制

效果.

2.2 槲皮素對供試菌生長的影響

由圖1A可以看出，在對照組中大腸桿菌正常生長，有明顯的延滯期、指數(shù)期、平

穩(wěn)期等特征；用100 μM、200 μM、400 μM的槲皮素處理后，大腸桿菌的生長

速度明顯減緩，缺乏對數(shù)生長期，菌數(shù)只是小幅上升，沒有明顯的平穩(wěn)期，菌體濃

度即表現(xiàn)為下降趨勢.而槲皮素作用金黃色葡萄球菌后，加藥組與對照組生長曲線

相同，說明在該濃度下槲皮素對金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑制作用(圖1B).

2.3 槲皮素對供試菌蛋白利用的影響

槲皮素處理大腸桿菌后，菌體蛋白的電泳譜帶與正常大腸桿菌的菌體蛋白電泳譜帶

呈現(xiàn)了較明顯的差別，尤其是200 μM的槲皮素作用后，部分譜帶變淺或消失(圖

2B)，表明槲皮素影響了大腸桿菌部分蛋白的正常表達(dá)，從而破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和正

常生理功能，最后抑制細(xì)菌的生長甚至菌體死亡.而不同濃度的槲皮素作用金黃色

葡萄球菌后，菌體蛋白電泳譜帶沒有發(fā)生明顯變化(圖2A).

2.4 堿性磷酸酶活性實驗

堿性磷酸酶(AKP)存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間，它不能自由透過細(xì)菌細(xì)胞壁.因此，

在細(xì)菌細(xì)胞壁完好的情況下，在胞外不能檢出AKP的活性，但當(dāng)細(xì)胞壁收到損傷

后，胞外AKP的活性將大量增強(qiáng)，其AKP的變化情況間接的檢測細(xì)胞壁的破壞程

度[13].從圖3可以看出槲皮素作用大腸桿菌60 min后，菌液中堿性磷酸酶活性逐

漸增加，說明槲皮素對大腸桿菌的細(xì)胞壁有了一定的作用.但是槲皮素作用金黃色

葡萄球菌后，其堿性磷酸酶活性沒有特別明顯的變化.這一結(jié)果和前面的槲皮素對

大腸桿菌有明顯抑菌效果而對金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑菌效果是一致的.

本文研究表明槲皮素對大腸桿菌有明顯的抑制作用，而對金黃色葡萄球菌的作用較

弱.進(jìn)一步試驗結(jié)果表明，槲皮素可能機(jī)制是通過破壞細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、改變細(xì)菌

蛋白的表達(dá)譜，進(jìn)而對大腸桿菌產(chǎn)生明顯的抑制作用；此外，由于革蘭氏陽性菌和

革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)上的差異，造成其對金黃色葡萄球菌抑制作用的降低.

*通信作者：張元新，E-mail:*****************