密碼子優(yōu)化的蛋白酶k在畢赤酵母中的表達(dá)及分離純化

2023年12月4日發(fā)(作者：國慶節(jié)作文600字作文)

大連理工大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明作者鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成果。盡我所知，除文中已經(jīng)注明引用內(nèi)容和致謝的地方外，本論文不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表的研究成果，也不包含其他已申請學(xué)位或其他用途使用過的成果。與我一同工作的對本研究所做的貢獻(xiàn)均已在論文中做了明確的說明并表示了謝意。若有不實(shí)之處，本人愿意承擔(dān)相關(guān)法律責(zé)任。學(xué)位論文題目：瓷塑查逝籩黯西睦垡查噬晝墊氌幽盔紐魚作者簽名：墊：叢數(shù)日期：絲咝年—上月—Ｉ坦日大連理一大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩十學(xué)位論文摘要蛋白酶Ｋ是由林伯氏白色念球菌（ＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍＬｉｍｂｅｒ）分泌的一種重要的絲氨酸蛋白酶，具有較高的蛋白水解活性。蛋白酶Ｋ多用于一些生化實(shí)驗(yàn)中，如在核酸提取中，可以除去核酸中的ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶；在原位雜交中，蛋白酶Ｋ具有降解包圍靶ＤＮＡ蛋白質(zhì)的作用，可以用來處理雜交前的樣本，提高檢測的敏感性?，F(xiàn)在商業(yè)化供應(yīng)的蛋白酶Ｋ主要由林伯氏白色念球菌分泌獲得。林伯氏白色念球菌生長緩慢，難以高密度培養(yǎng)，蛋白酶Ｋ的產(chǎn)量較低。另外，林伯氏白色念球菌還會分泌其他的蛋白酶，增加了下游分離純化的難度。本實(shí)驗(yàn)利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了蛋白酶Ｋ的分泌表達(dá)，省去了細(xì)胞破碎，ＤＮＡ沉淀等步驟，提高了產(chǎn)物的回收率。為了提高蛋白酶Ｋ的表達(dá)量及簡化分離純化工藝，本實(shí)驗(yàn)對蛋白酶Ｋ密碼子進(jìn)行了優(yōu)化，將蛋白酶Ｋ的密碼子都變成了畢赤酵母偏愛的密碼子，并在目的基因３’端加上六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，然后利用人工合成的方法獲得目的基因。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了蛋白酶Ｋ酵母表達(dá)載體，將其導(dǎo)入畢赤酵母ＧＳｌｌ５中實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，分泌的蛋白酶Ｋ可以利用Ｎｉ－ＮＴＡ親和層析柱進(jìn)行分離純化，減少了分離純化步驟，提高了蛋白酶Ｋ的收率。由于發(fā)酵條件對產(chǎn)物的表達(dá)量有很大影響，實(shí)驗(yàn)對誘導(dǎo)溫度、ｐＨ、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件。利用優(yōu)化的條件進(jìn)行５Ｌ發(fā)酵罐發(fā)酵，并通過測定了茵體生長曲線來確定開始誘導(dǎo)時(shí)間。在下游分離純化中，利用三種方法進(jìn)行純化，通過比較這三種純化方法的酶收率及比活，確定最佳的純化方法。結(jié)果表明，ｐＰＩＣ９Ｋ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ表達(dá)載體構(gòu)建正確，并實(shí)現(xiàn)了在畢赤酵母中的分泌表達(dá)。通過搖瓶發(fā)酵確定的最佳發(fā)酵條件為甲醇量Ｏ．７５％，溫度２５℃，ｐＨ７．０，誘導(dǎo)時(shí)間為１４４ｈ。利用優(yōu)化的條件進(jìn)行５Ｌ發(fā)酵罐發(fā)酵，蛋白酶Ｋ表達(dá)量可以達(dá)到２．２ｇ／Ｌ，比目前現(xiàn)有蛋白酶Ｋ工業(yè)生產(chǎn)方法的產(chǎn)率（０．３－０．５∥Ｌ發(fā)酵液）高４—７倍。最后，通過比較三種純化方法的酶收率及比活，可以看出，將去菌體后的發(fā)酵液直接通過Ｎｉ－ＮＴＡ親和層析柱層析，－ＩＤＡ得到較好的純化效果，無需對去菌體后的發(fā)酵液進(jìn)行前期處理，回收率可以達(dá)到８４％，酶的比活為１７５Ｕ／ｒａｇ。關(guān)鍵詞：蛋白酶Ｋ：密碼子優(yōu)化：酵母表達(dá)系統(tǒng)：分離純化蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｂｓｔｒａｃｔＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｉｓａｌｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｅｒｉｎｅｈａｓｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｔｅｎｓｉｖｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙｔｈｅｆｕｎｇｕｓｒｅｓｅａｒｃｈＴｒｉｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍＬｉｍｂｅｒ．Ｉｔａｔｔａｃｔｅｄｉｎｔｅｒｅｓｔｆｒｏｍｔｈｅａｃａｄｅｍｉｃ，ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｉｓｏｂｔａｉｎｅｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙｉｎｌａｒｇｅａｎａｏｕｎｔｓｂｙａｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ口脅“ｍＬｉｍｂｅｒ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ＴｒｉｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍＬｉｍｂｅｒｉｓｓｌｏｗｌｙｇｒｏｗｉｎｇｆｕｎｇｕｓｗｈｉｃｈｏｎｌｙｓｅｃｒｅｔｅｓｓｍａｌｌａｍｏｕｎｔｓｏｆｐｒｏｔｅａｓｅｓｉｎｔｏｔｈｅｉｓｕｎｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｍｅｄｉｕｍ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｉｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｎａｌａｒｇｅｓｃａｌｅ．ｉｍｐｒｏｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫａｎｄｓｉｍｐｌｉｆｙｔｈｅｏｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅｇｅｎｅｏｆｐｒｏｒｅｉｎａｓｅＫＷａｓｆｉｒｓｔｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂａｓｅｄｔｈｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄｃｏｄｏｎｕｓａｇｅｏｆＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ，ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｓｉｘｈｉｓｔｉｄｉｎｅＧＳ１１５．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｗａｓｇｅｎｅＷａｓｆｕｓｅｄｉｎｆｒａｍｅｗｉｔｈａｓｔｒｉｎｇｏｆｒｅｓｉｄｕｅｓ（Ｈｉｓ６－Ｔａｇ）ａｎｄｔｈｅｎｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｔｉｎｔｏＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓｓｅｃｒｅｔｏｒｙｆｏｒｍｉｎＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５、ｗｈｉｃｈｓｅｃｒｅｔｅｄａｓａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄａｓｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｅｆｏｒｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｓｕｃｈｔｈｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｏｆｍｅｔｈａｎｏｌ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨａｎｄｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅｗａｓＷｅａｌｓｏｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｐｕｒｉｆｙｉｎｇｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ａｎｄｓｄｅｅｔｔｈｅｂｅｓｔｏｎｅ．１１１ｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ．ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫＣａｌｌｂｅｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｔｈｅＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５ａｓａｓｏｌｕｂｌｅｆｏｒｍ．１１１ｅｏｐｔｉｍａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｏｆｍｅｔｈａｎｏｌＯ．７５％，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ２５＂Ｃ，ｐＨ７．０．ＵｎｄｅｒｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄＷａｓａｂｏｕｔｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｆｉｎａｌｙｉｅｌｄｏｆ２．２９ｐｅｒｌｉｔｅｒｏｆｃｕｌｔｕｒｅ．ＢｙｃｏｍｐａｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｓｕｐｅｍａｔａｎｔｆｒｏｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｕｒｉｆｙｉｎｇｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｔｈａｔｂｒｏｔｈｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫＷａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＮｉ－ＮＴＡａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｄｉｒｅｃｔｌｙｉｓｔｈｅｂｅｓｔｏｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅｎｉａｓｅＫ；ｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙＳｔｅｍ；ｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ大連理：］！大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文目摘Ａｂｓｔｒａｃｔ錄要………一…………………………………………………………………………………………………Ｉ．…．…．…．．…．…．…．…．……．．…．……．…．．…．…．．…………．．…．．………．……………．……．．…．ＩＩ引１言……………………………………………………………………………………………………．．．１．文獻(xiàn)綜述…………………………………………………………………………．．２．１．１蛋白酶Ｋ的研究進(jìn)展……………………………………………………．．２．１．１．１蛋白酶Ｋ的發(fā)現(xiàn)…………………………………………………一２．蛋白酶Ｋ的酶學(xué)特性……………………………………………一３．１．１．２蛋白酶Ｋ的分子生物學(xué)研究……………………………………一２．１．１．３１．１．４蛋白酶Ｋ的應(yīng)用…………………………………………………一４．１．１．５蛋白酶Ｋ的生產(chǎn)現(xiàn)狀及研究進(jìn)展………………………………一６．１．２酵母表達(dá)系統(tǒng)……………………………………………………………一７．１．２．１酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)………………………………………………．７．１．２．２畢赤酵母的生物學(xué)特性……………………………………………．８．１．２．３巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)宿主茵…………………………………．８．１．２．４畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)載體種類………………………………………．９．１．２．５影響外源基因高效表達(dá)的因素…………………………………．．１２．１．３２２．１本實(shí)驗(yàn)的研究目的及意義……………………………………………一１３．目的基因的獲得及ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ表達(dá)載體的構(gòu)建……………………一１５．引言………………………………………………………………………………………………．１５．２．２實(shí)驗(yàn)材料與試劑…………………………………………………………．１５．２．２．１材料和試劑………………………………………………………．．１５．２．２．２２．２．３２．３實(shí)驗(yàn)儀器…………………………………………………………．．１６．主要溶液劑配制方法……………………………………………．．１６．蛋白酶Ｋ密碼子的優(yōu)化及人工合成……………………………．１６．ｐＰＩＣ９Ｋ載體及目的基因的雙酶切………………………………．１７．酶切產(chǎn)物的回收…………………………………………………．．１７．ｐＰＩＣ９Ｋ載體與目的基因的連接…………………………………．１８．Ｅ．ｃｏｌｉ實(shí)驗(yàn)方法…………………………………………………………………．１６．２．３．１２．３．２２．３．３２．３．４２．３．５ＤＨ５ａ感受態(tài)的制備………………………………………．１８．２．３．６連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定……………………．……………………．１９．２．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論…………………………………………………………．２０．３４蛋白酶Ｋ的分離純化……………………………………………………………．４４．蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化２．４．１優(yōu)化后蛋白酶Ｋ密碼子序列……………………………………．２０．２．４．２ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定…………………………．．２１－２．５小結(jié)………………………………………………………………………．２３．蛋白酶Ｋ在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及條件優(yōu)化……………………………一２４．３．１前言………………………………………………………………………………………………．２４．３．２實(shí)驗(yàn)材料與試劑…………………………………………………………．２４．３．２．１材料與試劑………………………………………………………．．２４．３．２．２主要實(shí)驗(yàn)儀器……………………………………………………．．２４．３．２．３主要試劑及配制方法……………………………………………．．２５．３．３實(shí)驗(yàn)方法…………………………………………………………………．２６．３．３．１ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒的線性化及質(zhì)粒的純化……………………．．２６．３．３．２畢赤酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化…………………………………．．２７．３．３．３高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及ＰＣＲ鑒定…………………………．２８．３．３．４蛋白酶Ｋ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ電泳鑒定及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析………．２９．３．３．５蛋白酶Ｋ活性測定………………………………………………．３２．３．３．６搖瓶中蛋白酶Ｋ表達(dá)條件的優(yōu)化………………………………．３３．３．３．７發(fā)酵罐中蛋白酶Ｋ的誘導(dǎo)表達(dá)及濃度測定……………………．３４．３．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論…………………………………………………………．３５．３．４．１畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選………．………．３５．３．４．２蛋白酶Ｋ的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳鑒定及活性測定…………………．３７．３．４．３蛋白酶Ｋ樣品的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析……………………………．３８．３．４．４誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白酶Ｋ表達(dá)量的影響……………………………．３８．３．４．５誘導(dǎo)劑濃度對蛋白酶Ｋ表達(dá)量的影響…………………………．３９．３．４．６誘導(dǎo)ｐＨ對蛋白酶Ｋ表達(dá)的影響………………………………．．４０．３．４．７誘導(dǎo)溫度對蛋白酶Ｋ表達(dá)量的影響……………………………．４１－３．４．８發(fā)酵罐發(fā)酵表達(dá)蛋白酶Ｋ………………………………………．．４２．３．５小結(jié)………………………………………………………………………………………………．４３．４．１引言………………………………………………………………………………………………．４４．４．２實(shí)驗(yàn)材料與試劑…………………………………………………………．４４．４．２．１材料和試劑………………………………………………………．．４４．大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩十學(xué)位論文４．２．２主要實(shí)驗(yàn)儀器……………………………………………………．．４４．４．２．３主要溶液及配制方法……………………………………………．一４５．４．３實(shí)驗(yàn)方法…………………………………………………………………．４５．４．３．１硫酸銨梯度沉淀…………………………………………………．．４５．４．３．２透析……………………………………………………………………………………．．４５．４．３．３４．３．４Ｎｉ．ＮＴＡ親利層析柱層析………………………………………一４５．ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳分析……………………………………………．．４６．４．３．５三種純化方法對蛋白酶Ｋ的純化………………………………．４７．４．３．６純化后樣品收率及比活的測定…………………………………．．４７．４．３．７菌株遺傳穩(wěn)定性分析……………………………………………．．４８．４．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論…………………………………………………………．．４８．４．４．１４．４．２４．４．３蛋白酶Ｋ的硫酸銨梯度沉淀……………………………………．４８．Ｎｉ－ＮＴＡ親和層析分離蛋白酶Ｋ………………………………一４８．三種純化方法的比較……………………………………………．．４９．４．４．４菌株遺傳穩(wěn)定性分析……………………………………………．．５０．４．５小結(jié)…………………………………………………．…………………………………………．．．５１．結(jié)論與展望…………………………………………．．：……………………………一５２．參考文獻(xiàn)…………………………………………………………………………．５４．附錄Ａ優(yōu)化前后蛋白酶Ｋ基因序列比較及氨基酸序列………………………．５９．攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況……………………………………………．．６０．致謝………………………………………………………………………………．．…………………．．６１．大連理工大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書…………………………………………．．６２．大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文引言絲氨酸蛋白酶是以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶，在生物體內(nèi)起著重要的作用。蛋白酶Ｋ屬于絲氨酸蛋白酶類，是由林伯氏白色念球菌分泌的一種重要的蛋白酶，在生化實(shí)驗(yàn)、洗滌行業(yè)及污水處理等方面有較高的應(yīng)用價(jià)值。目前商業(yè)上供應(yīng)的蛋白酶Ｋ主要是通過林伯氏白色念球菌分泌得到，向培養(yǎng)基中加入大豆粉、奶粉或ＢＳＡ等作為氮源，在菌體進(jìn)入生長穩(wěn)定期后就會分泌蛋白酶Ｋ。但是由于林伯氏白色念球菌分泌的蛋白酶Ｋ產(chǎn)量低，并且對林伯氏白色念球菌進(jìn)行基因操作也比較困難，很難實(shí)現(xiàn)蛋白酶Ｋ的高效大規(guī)模生產(chǎn)。林伯氏白色念球菌還會分泌其他的蛋白酶，也增加了蛋白酶Ｋ分離純化的難度。傳統(tǒng)的分離純化方法一般經(jīng)過超濾．陽離子柱．超濾．陰離子柱等過程，由于純化步驟復(fù)雜，導(dǎo)致酶收率較低，目前工業(yè)生產(chǎn)蛋白酶Ｋ的產(chǎn)率為０．３．０．５∥Ｌ發(fā)酵液。生產(chǎn)蛋白酶Ｋ的成本較高，這對蛋白酶Ｋ的大規(guī)模應(yīng)用帶來了一定的限制。因此利用基因工程技術(shù)，通過對蛋白酶Ｋ基因的改造，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，簡化分離純化步驟是現(xiàn)階段的研究重點(diǎn)。利用基因工程技術(shù)，將外源基因?qū)胛⑸?、動物或植物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量表達(dá)，已成為現(xiàn)階段蛋白大量表達(dá)的一種趨勢，具有廣闊的發(fā)展前景。由此發(fā)展起來的外源基因表達(dá)系統(tǒng)包括原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)等已廣泛應(yīng)用于多種外源基因的表達(dá)。由于不同的表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)周期、蛋白表達(dá)量、蛋白加工修飾及操作難易層度等方面存在著很大差異，所以根據(jù)外源蛋白的特性及應(yīng)用目的來選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是上世紀(jì)８０年代初期發(fā)展起來的一種重要的外源蛋白表達(dá)技術(shù)，據(jù)報(bào)道已有５００多種外源蛋白利用該表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)。這種表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單，表達(dá)量高，可以進(jìn)行糖基化修飾，分泌表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，并且畢赤酵母可以高密度培養(yǎng)，也便于工業(yè)化生產(chǎn)。但酵母表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)物表達(dá)量受多種因素的影響，如溫度、ｐＨ、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等，除此之外，外源基因密碼子序列對產(chǎn)物表達(dá)量也有較大的影響。因此，為了得到較高的產(chǎn)量，還需對發(fā)酵條件及密碼子序列進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了蛋白酶Ｋ的分泌表達(dá)，并通過密碼子優(yōu)化及發(fā)酵條件優(yōu)化提高了蛋白酶Ｋ的表達(dá)量。通過基因操作技術(shù)，在蛋白酶Ｋ基因的３’端加上六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，可以將去菌體后的發(fā)酵液直接通過Ｎｉ－ＮＴＡ親和層析柱層析，減少了純化步驟，提高了酶收率。為工業(yè)化生產(chǎn)蛋白酶Ｋ提供了一定的理論依據(jù)。蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化１文獻(xiàn)綜述１．１蛋白酶Ｋ的研究進(jìn)展１．１．１蛋白酶Ｋ的發(fā)現(xiàn)林伯氏白色念球菌（ＴｒｉｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍＬｉｌｎｂｅｒ）屬于叢梗孢科，真菌。當(dāng)培養(yǎng)基中加入外源性氮源如蛋白胨、酵母提取物、奶粉或大豆粉等，該菌體會分泌多種蛋白酶。而一些無機(jī)氮源如銨鹽、蔗糖等會對產(chǎn)物的表達(dá)起到抑制作用…。蛋白酶Ｋ就是由由林伯氏白色念球菌分泌的一種重要的絲氨酸蛋白酬２１。研究發(fā)現(xiàn)，在菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期后，蛋白酶Ｋ才開始分泌【３１。早在１９７４年ＷｏｌｆｇａｎｇＥｂｅｌｉｎｇ［４】等利用結(jié)晶、色譜層析等方法在林伯氏白色念球菌的培養(yǎng)基中分離純化出了蛋白酶Ｋ，并測定其分子量為１８５００－士５００Ｄａ，隨后在１９８６年Ｋｌａｕｓ．ＤｉｅｔｅｒＪａｎｙｔ５】等通過分析蛋白酶Ｋ的氨基酸序列，精確測定出蛋白酶Ｋ的分子量為２８９３０Ｄａ。自從蛋白酶Ｋ被發(fā)現(xiàn)以后，人們對蛋白酶Ｋ的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)作了一系列研究。通過對蛋白酶Ｋ結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)蛋白酶Ｋ活性位點(diǎn)處的結(jié)構(gòu)與枯草芽孢桿菌有較高的同源性，所以蛋白酶Ｋ也屬于枯草桿菌蛋白酶類家族ｆ５，６１。蛋白酶Ｋ作為絲氨酸蛋白酶，具有廣泛的底物特異性和較高的蛋白水解活性，能夠優(yōu)先水解與含硫巰基、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸Ｃ末端相連的肽鍵和脂鍵，可以用來降解蛋白質(zhì)生成短肽【Ｊ７’９］。蛋白酶Ｋ對天然蛋白質(zhì)和非天然蛋白質(zhì)都有較高的蛋白水解活性，并且這種酶在含有尿素或ＳＤＳ的環(huán)境中仍有較高的活性［１們，正是由于蛋白酶Ｋ的這一重要性質(zhì)，蛋白酶Ｋ已在生物實(shí)驗(yàn)【１１｜、洗滌行業(yè)及污水處理等方面得到廣泛應(yīng)用。１．１．２蛋白酶Ｋ的分子生物學(xué)研究通過對蛋白酶Ｋ堿基序列的分析，結(jié)果表明蛋白酶Ｋ基因包括兩個(gè)外顯子和一個(gè)６３ｂｐ的內(nèi)含子。兩個(gè)外顯子編碼一個(gè)１５個(gè)氨基酸的信號肽，９０個(gè)氨基酸的前導(dǎo)肽和２７９個(gè)氨基酸的蛋白酶Ｋ的成熟肽。在蛋白酶Ｋ前體轉(zhuǎn)錄翻譯運(yùn)輸至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后，前導(dǎo)肽被切除，酶原前體轉(zhuǎn)變成成熟的蛋白酶Ｋ［１２１。蛋白酶Ｋ結(jié)構(gòu)中還含有兩個(gè)二硫鍵和一個(gè)自由的半胱氨酸【５】。通過Ｘ射線衍射技術(shù)分析蛋白酶Ｋ的三維空間結(jié)構(gòu)，數(shù)據(jù)表明蛋白酶Ｋ呈球狀結(jié)構(gòu)（圖１．１），是由１５個(gè)Ｂ折疊股、６個(gè)ａ螺旋、和一個(gè)３／１０螺旋構(gòu)成。球體內(nèi)部是由兩個(gè)ａ螺旋和一個(gè)由９個(gè)６折疊股構(gòu)成的平行￥結(jié)構(gòu)構(gòu)成，這兩個(gè)ａ螺旋埋于蛋白酶Ｋ內(nèi)部，由其他四個(gè)兩性ａ螺旋包圍。球體外部是由四個(gè)ａ螺旋和三個(gè)分別由兩個(gè)Ｂ折疊股構(gòu)成的反平行Ｇ結(jié)構(gòu)構(gòu)成。大連理：ｌ：火學(xué)專業(yè)學(xué)位碩十學(xué)位論文蛋白酶Ｋ屬于絲氨酸蛋白酶【６】，是絲氨酸家族中活性最高的一種酶【１３］。絲氨酸蛋白酶類家族包括胰蛋白酶類和枯草桿菌蛋白酶類兩大家族，一般的枯草桿菌蛋白酶類不含有二硫鍵，但是蛋白酶Ｋ的氨基酸序列及三維空間結(jié)構(gòu)都與枯草桿菌蛋白酶類有高度的相似性，所以蛋白酶Ｋ也歸為枯草桿菌酶類家族。但是正是由于這兩個(gè)二硫鍵的存在，蛋白酶Ｋ比其他的枯草桿菌蛋白酶具有更高的穩(wěn)定性【１４］。ｌ圖１．１Ｆｉｇ．１．１蛋白酶Ｋ分子三維空間結(jié)構(gòu)【ｌ副ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫＴｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒ１．１．３蛋白酶Ｋ的酶學(xué)特性蛋白酶Ｋ是枯草桿菌蛋白酶類中具有較高活性的一種絲氨酸蛋白酶，具有較廣的切割活性，可以切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。通過測定蛋白酶Ｋ在不同ｐＨ環(huán)境及不同溫度條件下的水解活性，結(jié)果顯示在ｐＨ范圍為７．５－１２．０內(nèi)蛋白酶Ｋ都具有較高的蛋白水解活性，一般條件下蛋白酶Ｋ使用的ｐＨ范圍是７．５－９．０之間。蛋白酶Ｋ在２０－６０℃之間活性都可以達(dá)到８０％以上，但在３７℃時(shí)酶活性最高。蛋白酶Ｋ與其他蛋白酶的區(qū)別還在于該酶在含有ＴｒｉｔｏｎＸ．１００、尿素或ＳＤＳ的環(huán)境中仍能穩(wěn)定存在且具有活性【ｌ６｜，這一特性使它的應(yīng)用很廣泛。蛋白酶Ｋ具有絲氨酸蛋白酶所具有的催化三聯(lián)體Ａｓｐ３９．Ｈｉｓ６９．Ｓｅｒ２２４結(jié)構(gòu)，，在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，Ｓｅｒ２２４的主要作用是進(jìn)行親核攻擊，而Ｈｉｓ６９在不同的階段可以作為質(zhì)子受體或供體，Ａｓｐ３９的作用可能是將Ｈｉｓ６９正確定位來輔助Ｓｅｒ２２４進(jìn)行親核攻擊【ｌ５１。分子動力學(xué)模型揭示了Ｈｉｓ６９與Ａｓｐ３９之間的靜電作用要比Ｈｉｓ６９與Ｓｅｒ２２４之間的靜電作用強(qiáng)，這也使Ｈｉｓ６９與Ａｓｐ３９之間的結(jié)合更穩(wěn)定和牢固【ｌ‘Ｌ１８】，這種結(jié)構(gòu)可能有助于電子的蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化傳遞，對三聯(lián)體中咪唑集團(tuán)的正確定位有重要的作用。而Ｈｉｓ６９與Ｓｅｒ２２４之間較弱的靜電作用，可以使Ｓｅｒ２２４有較大的空間自由度，這有助于Ｓｅｒ２２４接受質(zhì)子或進(jìn)行親核攻擊，進(jìn)而釋放水解后的蛋白產(chǎn)物。蛋白酶Ｋ結(jié)構(gòu)中含有兩個(gè)Ｃａ２＋結(jié)合位點(diǎn)，雖然這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與酶的活性中心有一定距離，但研究發(fā)現(xiàn)Ｃａ２＋對蛋白酶的活性具有一定的作用。用ＥＤＴＡ去除去ｃＥ＋后，發(fā)現(xiàn)蛋白酶Ｋ的活性只保留了原來活性的２０％，但是這種活性的降低具有一定的可逆性，當(dāng)去除ＥＤＴＡ．Ｃａ２＋復(fù)合體重新加入Ｃａ２＋后，蛋白酶Ｋ活性可以恢復(fù)至原來的２８％，但不會全部恢復(fù)活性【１９１。除去Ｃａ２＋還會降低蛋白酶Ｋ的熱穩(wěn)定性，這是由于除去Ｃａ２十后提高了蛋白酶Ｋ結(jié)構(gòu)的靈活性，從而也降低了蛋白酶Ｋ的熱穩(wěn)定性及底物結(jié)合能力，但并不會影響酶的催化活性【２０１。除了Ｃａ２＋會影響蛋白酶Ｋ的活性及穩(wěn)定性外，甘氨酸對蛋白酶的活性也有一定影響。在蛋白酶Ｋ的４０個(gè)保守區(qū)域中，其中有１３處是甘氨酸結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)研究報(bào)道，甘氨酸突變或缺失對蛋白酶的催化活性和底物特異性有很大的影響，這主要是因?yàn)楦拾彼釋Φ鞍酌福私Y(jié)構(gòu)的靈活性尤其底物結(jié)合部位的靈活性有很大作用【２¨。蛋白酶Ｋ三級結(jié)構(gòu)呈球狀，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)是剛性的，比較穩(wěn)定，而外部則是由多種環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成，尤其在底物結(jié)合區(qū)。這種結(jié)構(gòu)可以呈現(xiàn)出相當(dāng)多的構(gòu)象變化，有助于底物結(jié)合及催化，使得蛋白酶Ｋ比其他的枯草桿菌蛋白酶具有更廣的底物特異性，這也符合底物契合模型理論。１．１．４蛋白酶Ｋ的應(yīng)用（１）在核酸提取中的應(yīng)用核酸分離純化技術(shù)是分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中最常用的一項(xiàng)技術(shù)。在真核生物基因組中，ＤＮＡ通常纏繞在由組蛋白和其他非組蛋白形成的染色體上，并且被核纖層包裹，很難釋放出來。由于蛋白酶Ｋ較高的水解活性，可以降解與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)，在核酸的分離純化中起到重要的作用【２２塒］。蛋白酶Ｋ在較高溫度及含有尿素、ＥＤＴＡ、及去垢劑如１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００或０．５％ＳＤＳ等的環(huán)境中仍具有酶活性，這在提取高分子量核酸時(shí)具有很好的效果【２５，２６】。由于蛋白酶Ｋ對核酸酶具有水解作用［２７，２引，所以在核酸提取過程中，蛋白酶Ｋ可以用來抑制核酸的降解。尤其對于提?。遥危磷饔酶@著，因?yàn)椋遥危粒幔螅迤毡榇嬖谟诃h(huán)境中，而ＲＮＡ極不穩(wěn)定，特別容易被降解。ＲＮＡ的質(zhì)量對于ｃＤＮＡ合成及蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印記雜交分析等實(shí)驗(yàn)的成敗非常重要【２９】。ＳＤＳ可以抑制蛋白酶的活性，通常認(rèn)為提?。遥危?xí)r，加入ＳＤＳ可以起到保護(hù)ＲＮＡ的作用，但是研究發(fā)現(xiàn)，ＳＤＳ對核酸酶的抑制作用不會使其徹底失活，當(dāng)體系中除去ＳＤＳ后，ＲＮＡ還會被降解。由于蛋白酶Ｋ在含有ＳＤＳ的環(huán)境中也具有活性，所以提取ＲＮＡ?xí)r加入一定量的蛋白酶Ｋ大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文可以起到降解ＲＮＡａｓｅ的作用，對防止ＲＮＡ被降解具有明顯的作用。并且在含有ＳＤＳ時(shí)，蛋白酶Ｋ的降解效果會更明顯，這主要是因?yàn)椋樱模硬⒉粫岣呙傅幕钚?，而是改變了底物的?gòu)象，使其更易被蛋白酶Ｋ降解【３０】。（２）在原位雜交中的應(yīng)用在原位雜交技術(shù)中，蛋白酶Ｋ通常用來處理雜交前的標(biāo)本，消化包圍靶ＤＮＡ的蛋白質(zhì)，以便于檢測探針的穿透，提高檢測的敏感性【３ｌ’３３１。但是蛋白酶Ｋ的濃度和消化時(shí)間都會影響雜交效果。濃度過高或消化時(shí)間過長，都會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)細(xì)胞核消失及脫片等現(xiàn)象，影響核酸的結(jié)合。如在斑馬魚整體原位雜交實(shí)驗(yàn)【ｊｌｊ中對于４８ｈ胚胎用蛋白酶Ｋ消化３ｍｉｎ要比傳統(tǒng)消化２０ｒａｉｎ的效果要好，組織比較完整，雜交信號高。若濃度過低或消化時(shí)間過短，則靶核酸不能有效地暴露，核酸結(jié)合效果也不好。如在用原位雜交技術(shù)及原位ＲＴ．ＰＣＲ技術(shù)檢測蘋果莖痘病毒在梨樹組織中的分布時(shí)，利用蛋白酶Ｋ消化１０ｍｉｎ和１５ｍｉｎ的組織顯色后，呈一片藍(lán)色，說明消化不足；處理２５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ和４０ｍｉｎ的組織形態(tài)模糊，說明消化過度；處理２０ｍｉｎ的效果較好。由于蛋白酶Ｋ的活性與溫度有很大關(guān)系，所以消化時(shí)間也和溫度有關(guān)，蛋白酶Ｋ的最適溫度為３７℃，在這一溫度下消化時(shí)間較短，高于或低于這一溫度，都會使消化時(shí)間增加。很多研究對蛋白酶Ｋ的濃度及消化時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，但是由于組織結(jié)構(gòu)的不同，也不能一概而論。（３）用于病毒的滅活現(xiàn)在對生活中污水的處理一般利用消毒劑如次氯酸鈉、過氧化氫、過氧乙酸等。但是這些化學(xué)消毒劑對身體有一定害處，并且存在不便運(yùn)輸，對設(shè)備損害嚴(yán)重等問題【３４，３５】。病毒的外層結(jié)構(gòu)主要是衣殼蛋白，衣殼蛋白保護(hù)病毒不受外界環(huán)境的影響，并且也決定病毒感染的特異性。蛋白酶可以破壞病毒衣殼蛋白，從而干擾病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合。有研究［３６】比較了蛋白酶Ｋ與工業(yè)蛋白酶對病毒的滅活能力，結(jié)果顯示在適宜條件下，濃度為６７．５Ｕ／ｍＬ的蛋白酶Ｋ分別處理純水和生活污水１ｈ，對病毒的滅活率分別為９９．４％和４９．４％，處理３ｈ的滅活率分別為＞９９．９％和８１．１％。而濃度為７５Ｕ／ｍＬ的工業(yè)蛋白酶對純水處理１ｈ，病毒滅活率為７４．４％。這說明在污水處理方面蛋白酶Ｋ與其他工業(yè)蛋白酶相比還是具有很大優(yōu)勢。蛋白酶Ｋ不僅可以處理污水中的病毒，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也可以作為生物防治劑防治病毒蟲害【３７】。蛋白酶Ｋ作為消毒劑本身無害，而且不會產(chǎn)生有害的產(chǎn)物，是一種高效環(huán)保的方法。（４）在生物檢測中的應(yīng)用在研究傳染性海綿狀腦病和羊瘙癢病時(shí)，蛋白酶Ｋ可以用來檢測腦組織樣品中的致病性朊病毒蛋白。朊病毒（（ｐｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＰｒＰ）是傳染性海綿狀腦病的病原體，正常情況下，該病原體在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)沒有致病性，為細(xì)胞型朊病毒蛋白（（ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＰｒＰＣ），當(dāng)ＰｒＰＣ結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，會形成病毒型朊病毒（ｓｃｒａｐｉｅｐｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＰｒＰＳｃ）。ＰｒＰＣ與ＰｒＰＳｃ的區(qū)別就在于在標(biāo)準(zhǔn)條件下，ＰｒＰＣ可蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化以被蛋白酶Ｋ完全消化，而ＰｒＰＳｃ只能部分被消化。因此可以檢測經(jīng)蛋白酶Ｋ消化后的組織，如果有沒被消化的ＰｒＰＳｃ存在，則說明患有朊病毒病【３文３９］。（５）在其它行業(yè)的應(yīng)用由于蛋白酶Ｋ較高的水解活性及較廣的底物特異性，蛋白酶Ｋ在洗滌行業(yè)及皮革制品行業(yè)也具有較高的應(yīng)用價(jià)值。另外，蛋白酶Ｋ還可以用于肉類的嫩化。蛋白酶Ｋ可以水解肉中的肌纖維及結(jié)蹄組織中的蛋白質(zhì)，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，使部分肽鍵斷裂，肉質(zhì)吸水膨脹，質(zhì)地變嫩。１．１．５蛋白酶Ｋ的生產(chǎn)現(xiàn)狀及研究進(jìn)展目前商業(yè)上供應(yīng)的蛋白酶Ｋ主要是通過林伯氏白色念球菌分泌得到，培養(yǎng)基中加入外源蛋白如大豆粉、奶粉或ＢＳＡ等作為氮源時(shí)，在菌體進(jìn)入生長穩(wěn)定期后就會分泌多種蛋白酶如蛋白酶Ｔ、蛋白酶Ｒ和蛋白酶Ｋ等ｍ】。但是培養(yǎng)基中的葡萄糖和氨基酸會抑制蛋白酶的表達(dá)，所以只有當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖及氨基酸消耗盡后，才會分泌蛋白酶。傳統(tǒng)的蛋白酶Ｋ生產(chǎn)方法存在很多的缺陷，例如，林伯氏白色念球菌生長緩慢，并且通氣攪拌會破壞茵體的菌絲，難以高密度發(fā)酵。林伯氏白色念球菌分泌的蛋白酶Ｋ較少，還會分泌其他的蛋白酶，增加了下游分離純化的難度。傳統(tǒng)的分離純化方法一般經(jīng)過超濾．陽離子柱．超濾．陰離子柱等過程，純化步驟復(fù)雜，導(dǎo)致酶收率較低，目前工業(yè)生產(chǎn)蛋白酶Ｋ的產(chǎn)率為Ｏ．３—０．５∥Ｌ發(fā)酵液。蛋白酶Ｋ的生產(chǎn)成本較高，這對蛋白酶Ｋ的大規(guī)模應(yīng)用帶來了一定的限制。由于對林伯氏白色念球菌的基因操作要比對酵母菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等常用的基因工程菌困難。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，利用基因工程技術(shù)，通過對蛋白酶Ｋ基因的改造，實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，簡化分離純化工藝是現(xiàn)階段的研究重點(diǎn)。為了提高蛋白酶Ｋ的表達(dá)量，很多科研學(xué)者對改變蛋白酶Ｋ宿主菌做了多次嘗試。Ｇｕｎｋｅｌｔ４１］等通過提取林伯氏白色念球菌的ＲＮＡ，反轉(zhuǎn)錄得到ｃＤＮＡ，然后將蛋白酶Ｋ的ｅＤＮＡ轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了蛋白酶Ｋ的胞內(nèi)表達(dá)，可以檢測到活性，但表達(dá)量極低。酵母表達(dá)系統(tǒng)與原核表達(dá)系統(tǒng)相比具有很多優(yōu)勢，如分泌表達(dá)，便于分離純化；能夠進(jìn)行蛋白翻譯后的加工修飾；表達(dá)量較高等特點(diǎn)。并且林伯氏白色念球菌本身是一種真核生物，所以利用酵母表達(dá)系統(tǒng)更有利于蛋白酶Ｋ的表達(dá)。２００８年，ＲａｉｎｅｒＭｕｅｌｌｅ［１２】等構(gòu)建－］＂ｐＰＩＣＺａＡ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ及ｐＰＩＣ９Ｋ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了蛋白酶Ｋ阿分泌表達(dá)，證明了蛋白酶Ｋ可以在酵母體內(nèi)表達(dá)。這為以后商業(yè)化生產(chǎn)蛋白酶Ｋ提供了新思路。大連理：１：大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文１．２酵母表達(dá)系統(tǒng)１．２．１酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，形成了多種外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，如：原核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)包括酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞、植物或動物個(gè)體等心】。每種表達(dá)系統(tǒng)都有各自的優(yōu)勢和不足，所以要根據(jù)所表達(dá)的外源蛋白的特性及應(yīng)用目的來選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)。酵母表達(dá)系統(tǒng)已發(fā)展了多種酵母表達(dá)菌株，如巴斯德畢赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｐ．ｐ）、乳酸克魯維酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ．Ｋ１）、釀酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．＆ｃ）和多形漢遜酵母（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ．Ｈｐ）。其中應(yīng)用最早的是釀酒酵母，在制藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，但是這種酵母具有一定的不足，如表達(dá)量低，不易高密度發(fā)酵，外源蛋白分子量不宜過大等缺點(diǎn)。為了解決以上問題，１９６９年Ｏｇａｔａ等發(fā)現(xiàn)了巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，并于２０世紀(jì)８０年代迅速發(fā)展，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于多種外源蛋白的表達(dá)。據(jù)報(bào)道，到目前為止已有１０００多種蛋白利用該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點(diǎn)，但它的外源蛋白表達(dá)量是釀酒酵母的十倍甚至百倍，再加上它作為真核表達(dá)系統(tǒng)的一些優(yōu)勢，使畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)逐步成為一種非常有用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。巴斯德畢赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）是一種甲醇營養(yǎng)型酵母，巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展成為一種比較完善的被廣泛應(yīng)用于商業(yè)化重組蛋白表達(dá)的真核宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。隨著對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的研究越來越深入，越來越多的實(shí)驗(yàn)室和公司開始搭建畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的平臺。作為一種高效表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)主要具有以下優(yōu)點(diǎn)：（１）作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可以對外源蛋白進(jìn)行翻譯后的加工修飾，使外源蛋白更接近天然活性，尤其對于真核生物蛋白。（２）具有強(qiáng)有力的基因啟動子——醇氧化酶啟動子（ＡＯＸ），這種啟動子可以嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。（３）畢赤酵母生長較快，易于培養(yǎng)，對培養(yǎng)條件要求低，生產(chǎn)成本低，便于工業(yè)化生產(chǎn)。（４）適合高密度發(fā)酵，且發(fā)酵工藝成熟，進(jìn)行高密度發(fā)酵時(shí)細(xì)胞干重可以達(dá)到１５０ｇ／Ｌ以上【４３］。（５）表達(dá)量高，表達(dá)產(chǎn)物可以胞內(nèi)或胞外表達(dá)，當(dāng)外源蛋白含有信號肽序列時(shí)，就會實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。并且畢赤酵母本身分泌很少的蛋白，加上畢赤酵母生長培養(yǎng)蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化基中主要是無機(jī)鹽，含有極少量蛋白，所以分泌的外源的蛋白是培養(yǎng)基中蛋白的主要成分，這樣大大簡化了下游分離純化工藝，提高了產(chǎn)物收率。（６）性狀穩(wěn)定，目的基因轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)后可以整合到酵母基因上，隨著酵母的增殖而復(fù)制，不易丟失。研究比較深入，基因操作技術(shù)成熟。１．２．２畢赤酵母的生物學(xué)特性巴斯德畢赤酵母基因中含有一種醇氧化酶基因（ＡＯＸ），這種醇氧化酶可以代謝甲醇，所以畢赤酵母可以以甲醇為唯一的碳源，當(dāng)以甘油、葡糖糖或乙醇作為碳源時(shí)，醇氧化酶基因幾乎不表達(dá)。醇氧化酶基因包括ＡＯＸｌ和ＡＯＸ２兩種基因。由于ＡＯＸｌ基因的啟動子比ＡＯＸ２的啟動子強(qiáng)很多，所以甲醇的代謝主要是依靠ＡＯＸｌ醇氧化酶。當(dāng)表達(dá)載體與酵母基因組中的同源序列進(jìn)行同源重組時(shí)，根據(jù)菌株及基因插入位點(diǎn)的不同，形成不同表型的轉(zhuǎn)化子。（１）當(dāng)轉(zhuǎn)化子中含有ＡＯＸｌ基因時(shí)，菌體對甲醇的代謝效率較高，為甲醇利用型菌株（Ｍｕｔ＋）。（２）當(dāng)菌體中不含ＡＯＸｌ基因，只含有ＡＯＸ２基因時(shí)，甲醇代謝由ＡＯＸ２醇氧化酶負(fù)責(zé)，由于這種酶表達(dá)量較低，所以利用甲醇比較緩慢，為甲醇利用緩慢型菌株（Ｍｕｔ８）。（３）當(dāng)ＡＯＸｌ與ＡＯＸ２基因同時(shí)缺失時(shí)，酵母不分解甲醇，為甲醇不利用型菌株（Ｍｕｔ’）。畢赤酵母是一種需氧型微生物，最適生長溫度為２８－３０℃，溫度過高，對蛋白質(zhì)表達(dá)有害，甚至?xí)?dǎo)致菌體死亡，一般不能超過３２℃。在培養(yǎng)基ｐＨ為３．０—８．Ｏ的范圍內(nèi)都可以生長，但最適生長ｐＨ為６．０－７．０。在ＹＰＤ培養(yǎng)基中，甲醇利用型（Ｍｕｔ十）和甲醇利用緩慢型（Ｍｕｔ８）在對數(shù)期增值一倍的時(shí)間約是２ｈ。當(dāng)培養(yǎng)基中含有甲醇時(shí)，甲醇利用性在對數(shù)期增殖一倍的時(shí)間大約為４－６ｈ；甲醇利用緩慢型大約為１８ｈ。１．２．３巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)宿主菌畢赤酵母是一種甲醇營養(yǎng)型酵母。甲醇營養(yǎng)型酵母是指可以以甲醇為唯一碳源的酵母菌。這類酵母菌主要包括畢赤酵母屬（Ｐｉｃｈｉａ）、球擬酵母屬（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、漢遜酵母屬（脅ｎｓｅｎｕｌａ）、念珠酵母屬（Ｃａｎｄｉｄａ）、克勒克酵母（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）等。其中可以作為外源蛋白表達(dá)的菌株主要是多形漢遜酵母（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ／）及巴斯德畢赤酵母（Ｐｐａｓｔｏｒｉｓ），而巴斯德畢赤酵母在酵母表達(dá)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛。目前畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中所用的菌株都是由ＮＲＲＬ．Ｙ１１４３０菌改造得到。為了便于重組菌體的篩選，將野生型菌株改造成為營養(yǎng)缺陷型，如ＧＳｌ１５與ＫＭ７１在組氨酸脫氫酶（Ｈｉｓ４）處有突變，自身不能合成組氨酸，為組氨酸缺陷型，在基本培養(yǎng)基中不能生長，而所有的表達(dá)載體都有Ｈｉｓ４基因，可以與宿主細(xì)胞互補(bǔ)，通過不含組氨酸的培養(yǎng)基來篩選陽性轉(zhuǎn)化子。另外還有精氨酸缺陷型（Ａｒｇ’），在不含精氨酸的培養(yǎng)基中不大連理ｊＩ：大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩十學(xué)位論文能生長，也可以用來篩選重組子。除了營養(yǎng)缺陷型菌株外，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司還開發(fā)出了蛋白酶缺陷型菌株，如ＳＭＤｌｌ６３、ＳＭＤｌｌ６５、ＳＭＤｌｌ６８等。這類菌株基因組中缺失蛋白酶Ａ基因（ｐｅｐ４）和蛋白酶Ｂ基因（ｐｒｂｌ）。利用這類菌株表達(dá)外源蛋白，減弱了蛋白酶對外源蛋白的降解作用，尤其適用于分泌型表達(dá)。在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的高密度培養(yǎng)及少量菌體的破裂，都會導(dǎo)致發(fā)酵液中蛋白酶的增加，對分泌到培養(yǎng)基中的外源蛋白非常不利。常用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)宿主茵如表１．１所示：表１．１常用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)宿主菌Ｔａｂ．１．１Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｈｏｓｔｓｔｒａｉｎｓ１．２．４畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)載體種類目前已開發(fā)出了十幾種畢赤酵母表達(dá)載體ｍ】，如表１．２所示。根據(jù)載體轉(zhuǎn)入酵母體內(nèi)的存在形式，可以分為游離型和整合型，主要是整合型。整合性載體攜帶目的基因整合到畢赤酵母基因組中，可以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。根據(jù)外源蛋白分泌部位可以將載體分為胞內(nèi)表達(dá)載體和胞外表達(dá)載體。由于酵母自身分泌的蛋白很少，如果能夠?qū)崿F(xiàn)外源蛋白的分泌表達(dá)，則可以很方便的進(jìn)行蛋白的分離純化。對于一些自身含有分泌信號肽的外源蛋白，在任何酵母表達(dá)載體中都可以實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。如果蛋白自身不含有分泌信號肽，要想實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)，則要依靠胞外表達(dá)載體。胞外表達(dá)載體在目的基因上游含有分泌信蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化號序列，如ｐＰＩｃ９Ｋ（如圖１．２）。目前主要用的是ａ—ｆａｃｔｏｒ信號序列，該信號肽是源于釀酒酵母的交配因子（Ｏｔ—ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，Ｏｔ．ＭＦ），該信號肽不僅可以介導(dǎo)外源蛋白分泌到胞外，并且在分泌過程中還可以被自身的膜蛋白酶Ｋｅｘ２自動切割掉，不會使外源蛋白增加額外的氨基酸。除了ａ—ｆａｃｔｏｒ信號肽外，還有ｉｎｖｅｒｔａｓｅ信號肽ＳＵＣ２和酸性磷酸酶信號肽ＰＨＯ等。ＣｏｍｍｅｎｔｓｆｏｒｐＰＩＣ９Ｋ：９２７６ｎｕｃｌｏｏｔｉｄｅｓ５‘Ａｏｘｌｐｒｏｍ醴ｅｒｆｒａｇｍｅｎｔ：ｂａｓｅｓ＇－９４８５’ＡＯＸｌｐｎｍｅｒＳ跳：ｂａｓｅｓ８５５．８７５“．Ｆａｃｔｏｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ（ｓＬｂａｓｅｓ９４９－１２１８ｏ．ＦａｃｔｏｒＤｎｍｅｒｓｉｔｅ：ｂａｓｅｓ＂５２．１１７２Ｍｕ協(xié)ＤｌｅＣｔｏｎｉｎ０３。ＡＯ×７Ｓ酏：ｂａｓｅｓ１１９２．１２４＇ｉ，＇３’ＡＯＸｌＤｎｍｅｒｓｉｔｅ：ｂａｓｅｓｊ３２７—１３４７Ｉｒａｎｓｃｔｌ酬Ｏｎ１２５３．１５８６ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ仃＾ｒ）：ｂａｓｅｓＨ１３４ＯＲＦ：ｂａｓｅｓ４５１４—１９８０Ｋａｎａｍｙｃｉｎｇｅｎｅ：ｂａｓｅｓ５７４Ⅻ９２８３’＾Ｃ＊７ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｂａｓｅｓ６１２２．６８７９ｐＢＲ３２２ｏｒｉｇｉｎ：ｂａｓｅｓ７９６１—７２８８Ａｍｐｉｃｉｌｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ：ｂａｓｅｓ８９６＆．８１０６圖１．２Ｆｉｇ．１．２ｐＰＩＣ９Ｋ質(zhì)粒圖譜ｇｅｎｅｍａｐｏｆｐＰＩＣ９Ｋ除了信號肽以外，酵母表達(dá)載體中還含有其他的一些主要元件，如啟動子、多克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)記等。（１）啟動子畢赤酵母最常用的啟動子為醇氧化酶啟動子ＡＯＸ，醇氧化酶基因包括ＡＯＸｌ和ＡＯＸ２兩種基因。其中ＡＯＸｌ是一種強(qiáng)啟動子，可以實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效表達(dá)【４５，４６］，并且還能精確調(diào)控外源蛋白的表達(dá)。因?yàn)椋粒希兀齑佳趸笇状嫉拇x效率很高，含有ＡＯＸｌ啟動子的轉(zhuǎn)化子，可以通過調(diào)節(jié)甲醇的濃度控制外源蛋白的表達(dá)及表達(dá)量。如果載體上僅含有ＡＯＸ２啟動子，則對甲醇的代謝降低，只依靠甲醇難易維持菌體的正常生長，在菌體生長階段可以添加一些替代性碳源，如甘露醇、山梨醇等。這些碳源不會抑制ＡＯＸ酶的誘導(dǎo)表達(dá)，還會維持菌體的正常生長【４７，４８】。除了ＡＯＸ醇氧化酶啟動子之外，三磷酸甘油醛脫氫酶（ＰＧＡＰ）啟動子也是酵母常用的一種較強(qiáng)的表達(dá)啟動子。如果使用該啟動子，在誘導(dǎo)外源蛋白時(shí)可以不大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文使用甲醇作為碳源。通過比較不同的碳源的表達(dá)效果，發(fā)現(xiàn)蔗糖作為碳源的表達(dá)效果最好【４引。除了上述描述的啟動子之外，ＹＰＴｌ啟動子（ＧＴＰａｓｅ基因啟動子）、ＰＦＬＤｌ啟動子（甲醛脫氫酶啟動子）和ＤＨＡＳ啟動子（二羥基丙酮合成酶啟動子）也是高效表達(dá)的啟動子。并且這些啟動子也可以由甲胺或甲醇為唯一碳源誘導(dǎo)表達(dá)。（２）篩選標(biāo)志畢赤酵母表達(dá)載體的篩選基因一般為組氨酸脫氫酶基因，由于表達(dá)宿主菌為組氨酸缺陷型，只有當(dāng)含有目的基因的載體轉(zhuǎn)入宿主菌中時(shí)，宿主菌才可以在組氨酸缺陷型培養(yǎng)基上生長。但是也會出現(xiàn)假陽性轉(zhuǎn)化子現(xiàn)象，因?yàn)榻湍富蚪M中的ＨＩＳ４位點(diǎn)與載體上的ＨＩＳ＋基因進(jìn)行基因重組時(shí)會出現(xiàn)營養(yǎng)缺陷型的恢復(fù)突變，即使宿主菌中不含有表達(dá)載體，也會在營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基中生長，假陽性轉(zhuǎn)化子的比例會占總轉(zhuǎn)化子的１０％一５０％，利用電轉(zhuǎn)化時(shí)，比例會更高一些。一般情況下，目的基因拷貝數(shù)的的增加可以增加外源蛋白的表達(dá)量。有些載體如ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ中含有卡那霉素抗性基因，這一基因會使宿主菌對Ｇ４１８抗生素產(chǎn)生抗性。一般拷貝數(shù)越多，對Ｇ４１８的耐受性越高，所以可以通過提高Ｇ４１８濃度篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。但是由于這些載體分子量較大，體外克隆較困難，并且轉(zhuǎn)化宿主菌后遺傳穩(wěn)定性差，后來又尋找到了新的抗性基因——Ｓｈｂｌｅ基因，開發(fā)了ｐＰＩＣＺ系列載體。該基因可以使宿主菌產(chǎn)生ｚｅｏｃｉｎ抗生素抗性，含有ｚｅｏｃｉｎ抗性的載體只有５＇ＡＯＸ的啟動子序列，ＡＯＸｌ轉(zhuǎn)錄終止序列和Ｓｈｂｌｅ基因序列，載體分力量較小，多克隆位點(diǎn)較多，體外操作簡單，且轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性較高ｉ（３）其他元件多克隆位點(diǎn)是載體所必須的元件，用于外源基因的插入。有些載體中還含有３＇ＡＯＸ終止序列，有利于３’端的加工和形成ｍＲＮＡＰｏｌｙＡ結(jié)構(gòu)。表１．２畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)常用載體‘５０，５１】Ｔａｂ．１．２Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化表１．２續(xù)Ｔａｂ．１．２Ｃｏｎｔ１．２．５影響外源基因高效表達(dá)的因素不同外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)水平存在很大差異，根據(jù)一些文獻(xiàn)報(bào)道，最高可以達(dá)到１２∥Ｌ【５２１，而最低的只有１ｍｇ／Ｌ，這種表達(dá)量的差異主要是由于外源基因自身序列及誘導(dǎo)表達(dá)條件引起的，而后者的影響更顯著【５３】。誘導(dǎo)表達(dá)條件包括誘導(dǎo)劑濃度、發(fā)酵溫度、培養(yǎng)基ｐＨ及誘導(dǎo)時(shí)間等。因此，提高外源蛋白的表達(dá)量，首先要對外源基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使其成為畢赤酵母偏愛的密碼子，其次對培養(yǎng)條件也要進(jìn)行優(yōu)化。下面對這些因素進(jìn)行詳細(xì)討論。（１）密碼子優(yōu)化生物體內(nèi)的密碼子具有簡并性，即一個(gè)氨基酸可以由多個(gè)密碼子編碼，這些密碼子稱為同義密碼子。不同物種對密碼子的使用具有偏愛性，也就是不同生物合成蛋白時(shí)使用密碼子的頻率不同。造成這種現(xiàn)象的原因可能與ｔＲＮＡ豐度有關(guān)，ｔＲＮＡ豐度即ｔＲＮＡ的數(shù)量。對于生物體來說，偏愛密碼子對應(yīng)的ｔＲＮＡ數(shù)量一般會較高，而稀有密碼子對應(yīng)的ｔＲＮＡ的數(shù)量相對較低。ｔＲＮＡ豐度越高則所對應(yīng)的密碼子的使用頻率越高【５４１。由于不同生物的偏愛密碼子不同，如果外源基因中某些密碼子對于畢赤酵母是稀有密碼子，可能會成為轉(zhuǎn)錄翻譯過程中的瓶頸，從而影響外源基因表達(dá)量。許多數(shù)據(jù)證明，優(yōu)化外源基因密碼子對提高外源蛋白表達(dá)量有顯著的作用，可以提高幾倍甚至數(shù)十倍【５孓５８Ｊ。因此在保證氨基酸序列不變的前體下，對外源基因序列進(jìn)行改造，盡量使用畢赤酵母偏愛密碼子，可以獲得高表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因菌株。對畢赤酵母密碼子的偏好性有不同的算法【５鞏圳，很多研究也也給出了酵母稀有密碼子及偏愛密碼子表，可以根據(jù)這些算法及偏愛密碼子統(tǒng)計(jì)表對目的基因密碼子序列進(jìn)行改造。另外，還可以通過一些密碼子優(yōu)化網(wǎng)站對密碼子序列進(jìn)行改造。大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文（２）ｐＨ畢赤酵母在ｐＨ３．０—８．０之間都可以生長，但不同外源蛋白的表達(dá)量、活性及穩(wěn)定性可能會受到ｐＨ的影響。選擇合適的ｐＨ進(jìn)行誘導(dǎo)，對提高外源蛋白表達(dá)量具有顯著的作用。例如，利用酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人血清白蛋白時(shí)，ｐＨ６．０時(shí)表達(dá)量最高１６¨，但細(xì)胞因子生長抑制肽在ｐＨ３．０時(shí)表達(dá)量最高卿。（３）溫度酵母最適生長溫度為２８－３０℃。一般來說，低溫可以抑制蛋白酶的降解，并有還助于蛋白的正確折疊【６３ｌ。也有報(bào)道表明，降低溫度可以削弱甲醇對菌體的毒性作用Ｍ】。但是溫度過低，菌體生長緩慢，表達(dá)量低。溫度過高，對蛋白表達(dá)有害。外源基因的最適表達(dá)溫度一般為２５－３０℃。（４）誘導(dǎo)劑濃度由于畢赤酵母是甲醇營養(yǎng)型酵母，可以以甲醇為唯一的碳源。甲醇可以誘導(dǎo)醇氧化酶啟動子，從而啟動外源基因的表達(dá)，所以甲醇的濃度對菌體的生長及外源蛋白的表達(dá)都有較大的影響。甲醇濃度過高，不利于酵母生長，會導(dǎo)致生長停止甚至死亡。但甲醇濃度較低，碳源不足，又會影響菌體活性，降低外源蛋白的表達(dá)量。為了減少甲醇對菌體的毒害作用，現(xiàn)在逐步采用混合流加方式，即甘油或山梨醇等碳源與甲醇一起作為菌體的碳源，汪志浩等【６５Ｊ研究發(fā)現(xiàn)，利用混合流加的方式可以提高堿性果膠酶的表達(dá)量，尤其甲醇與山梨醇的混合流加效果更為顯著?；旌狭骷臃绞郊葹榫w生長提供了所需的碳源，減少了甲醇的用量，提高了菌體的活性還添加了外源蛋白表達(dá)所需的誘導(dǎo)因子，增加了表達(dá)量。（５）溶氧量因?yàn)楫叧嘟湍笇儆诤醚跣途w，通氧量的增加可以有助于茵體生長及目的蛋白的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐發(fā)酵的表達(dá)量要比搖瓶發(fā)酵的表達(dá)量高１０－１００倍，主要原因就是發(fā)酵罐培養(yǎng)可以將通氧量控制在合理的范圍之內(nèi)，使菌體供養(yǎng)充足，能夠?qū)崿F(xiàn)菌體的高密度發(fā)酵，從而提高了外源蛋白的表達(dá)量ｍＪ。１．３本實(shí)驗(yàn)的研究目的及意義蛋白酶Ｋ作為一種重要的絲氨酸蛋白酶，不僅在生物科研方面應(yīng)用廣泛，在食品及飼料加工、醫(yī)藥行業(yè)、環(huán)境保護(hù)、資源和能源開發(fā)等領(lǐng)域都具有較高的應(yīng)用價(jià)值。面對日益增加的需求，提高蛋白酶Ｋ產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本成了現(xiàn)階段研究的重點(diǎn)。利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)成為目前生產(chǎn)外源蛋白的一種重要的手段。在這些外源基因表達(dá)系統(tǒng)中，酵母表達(dá)系統(tǒng)由于具有很多優(yōu)于其他表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)，如可以分泌表達(dá)，能夠?qū)ν庠吹鞍走M(jìn)行翻譯后的加工修飾，表達(dá)量高，成本低等，逐步成為一種重要的外源蛋白表達(dá)工具。本研究為了提高蛋白酶Ｋ的產(chǎn)量簡化分離純化工藝，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白酶Ｋ。實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化蛋白酶Ｋ密碼予序列，利用人工合成的方法獲得目的基因，并蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化構(gòu)建了ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ酵母表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了蛋白酶Ｋ在酵母中的分泌表達(dá)，并優(yōu)化了蛋白酶Ｋ表達(dá)條件及純化工藝，為蛋白酶Ｋ的大規(guī)模生產(chǎn)提供了依據(jù)。大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文２目的基因的獲得及ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ表達(dá)載體的構(gòu)建引言由于不同物種的偏愛密碼子不同，如果外源基因中某些密碼子對于畢赤酵母是?。玻庇忻艽a子，可能會成為轉(zhuǎn)錄翻譯過程中的瓶頸，從而影響外源基因表達(dá)量。本章主要利用密碼子優(yōu)化軟件對蛋白酶Ｋ密碼子進(jìn)行優(yōu)化，使其均成為畢赤酵母偏愛密碼子，然后利用基因合成的手段合成目的基因。為了便于下游蛋白酶Ｋ的分離純化，在目的基因Ｃ端添加了六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，利用親和層析的方法就可以將目的蛋白純化出來。目的基因Ｎ端保留了蛋白酶Ｋ自身的信號肽，由于蛋白酶Ｋ成熟后，信號肽會自動被切割掉，所以為了避免組氨酸標(biāo)簽被切掉，將組氨酸標(biāo)簽添加到目的基因Ｃ端。ｐＰＩＣ９Ｋ載體是酵母表達(dá)系統(tǒng)中常用的一種分泌表達(dá)載體。利用這種表達(dá)載體，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的分泌表達(dá)，省去了收集及破碎菌體的過程，并且畢赤酵母本身分泌很少的蛋白，非常有利用蛋白的分離純化。蛋白酶Ｋ本身就是一種分泌蛋白，分泌表達(dá)有助于蛋白酶的轉(zhuǎn)錄翻譯。。本章將合成的蛋白酶Ｋ克隆到ｐＰＩＣ９Ｋ載體上構(gòu)建酵母表達(dá)載體，在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。２．２實(shí)驗(yàn)材料與試劑２．２．１材料和試劑大腸桿菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｐＰＩＣ９Ｋ載體ＤＮＡ限制性內(nèi)切酶ＤＮＡｍａｒｋｅｒＴ４ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ本實(shí)驗(yàn)室保存本實(shí)驗(yàn)室保存寶生物工程有限公司（大連）寶生物工程有限公司（大連）寶生物工程有限公司（大連）ＤＮＡ連接酶ＤＮＡ凝膠回收試劑盒質(zhì)粒ＤＮＡ小提試劑盒瓊脂糖氯化鈉寶生物工程有限公司（大連）天根生物科技（北京）有限公司生工生物工程股份有限公司（上海）生工生物工程股份有限公司（上海）生工生物工程股份有限公司（上海）胰蛋白胨酵母膏瓊脂粉無菌雙蒸水生工生物工程股份有限公司（上海）生工生物工程股份有限公司（上海）本實(shí)驗(yàn)制備蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化２．２．２實(shí)驗(yàn)儀器超凈工作臺上海凈化設(shè)備廠ＰＣＲ儀寶生物工程有限公司（大連）凝膠成像系統(tǒng)上海新振儀器有限設(shè)備有限公司恒溫振蕩儀常州國華電器有限公司電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠電泳儀Ｅ．ＣＡｐｐａｒａｔｕｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ２．２．３主要溶液劑配制方法表２．１主要溶液及配制方法Ｔａｂ．２．ＩＴｈｅｍａｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｍｃｔｈｏｒｄｓ溶液配制方法胰蛋白胨１０９；酵母膏５９；氯化鈉１０９：加水定ＬＢ培養(yǎng)基（１Ｌ）容到１Ｌ，完全溶解后調(diào)ｐＨ至、７．０。１２１＂Ｃ高壓蒸汽滅菌２０ｍｉｎ。固體ＬＢ培養(yǎng)基需加１．５％瓊脂粉。Ｔｒｉｓ１×ＴＡＥ４．８４９：Ｎａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２００．７４４９；用醋酸調(diào)硼到８．５質(zhì)粒提取試劑：溶液Ｐ１１０ｒａｍＥＤＴＡ，５０ｒａＭ葡萄糖，２５ｍ＾ＩＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ＝８．０溶液Ｐ２Ｉ％ＳＤＳ０．２ＭＮａ０ＩＩ溶液Ｐ３３Ｍ醋酸鉀；２Ｍ冰醋酸２．３實(shí)驗(yàn)方法２．３．１蛋白酶Ｋ密碼子的優(yōu)化及人工合成參照ＧｅｎＢａｎｋ中蛋白酶Ｋ基因序列（ＧｅｎｎＢａｎｋ：ＤＤ０３１２７２．１），利用密碼子優(yōu)化軟件（ｈｔｔｐ：ｌｌｇｃｕａ．ｓｅｈｏｅｄｌ．ｄｅ／）分析，發(fā)現(xiàn)蛋白酶Ｋ基因中有多處是畢赤酵母的稀有密碼子，利用密碼子優(yōu)化軟件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ／）對蛋白酶Ｋ基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在不改變氨基酸序列的前提下，獲得優(yōu)化后的蛋白酶Ｋ的基因序列。在序列的５’端加上ＥｃｏＲＩ酶切位點(diǎn)，３’端加上六個(gè)組氨酸標(biāo)簽后再加ＮｏｔＩ酶切位點(diǎn)。然后將優(yōu)化構(gòu)建的基因序列送上海生工公司合成。合成的基因連到ＰＵＣ５７Ｔ．載體上。火連理Ｔ大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩十學(xué)位論文２．３．２ｐＰＩＣ９Ｋ載體及目的基因的雙酶切用ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ兩種限制性內(nèi)切酶分別雙酶切ｐＰＩＣ９Ｋ載體及ＰＵＣ５７Ｔ．ＰｒｏＫ質(zhì)粒，酶切體系如下：表２．２Ｔａｂ．２．２ｐＰＩＣ９Ｋ載體雙酶切體系體積１０ｌ兒ｐＰＩＣ９Ｋｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｙｓｔｅｒｍ成分ｐＰＩＣ９Ｋ載體ＥｃｏＲＩ０．５吐０．５１１ＬＮｏｔＩ１０×ＨＢＳＡｄｄＩ－１２０２皿２皿５１ｌＬＰＵＣ５７Ｔ．ＰｒｏＫ質(zhì)粒雙酶切體系表２．３Ｔａｂ．２。３ＰＵＣ５７Ｔ－ＰｒｏＫｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｙｓｔｅｒｍ成分ＰＵＣ５７Ｔ．ＰｒｏＫ質(zhì)粒ＥｃｏＲ體積１０１也Ｉ０．５皿０．５ｐＬＮｏｔＩ１０×ＨＢＳＡ２ｌ止ＥｒＩＥｄｄＨ２０５ｌ兒３７℃溫育５ｈ后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。２．３．３酶切產(chǎn)物的回收將酶切產(chǎn)物進(jìn)行１％瓊脂糖凝膠電泳。回收９３００ｂｐ大小的ｐＰＩＣ９Ｋ片段及１２００ｂｐ大小的蛋白酶Ｋ目的基因片段。酶切產(chǎn)物純化步驟如下：①在紫外燈下切下含有目的基因的瓊脂糖凝膠塊（盡量去除多余的凝膠，凝膠體積不要太大，＋以免影響回收效果），將膠塊切碎，加快溶膠過程。將膠塊收集到１．５ｍＬ離心管中。②向離心管中加入５００ｐＬ的溶膠試劑ＢｕｆｆｅｒＧＭ。室溫下靜置一段時(shí)間，使膠塊完全融化。若膠塊過大，可以在３７℃下加熱，期間應(yīng)間斷混合，加快膠塊融化。蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化③將試劑盒中的ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ安置于ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ上。④將上述溶液加入到ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｍｉｎ，棄濾液。如果想提ｍｉｎ，棄濾液。高回收率，可以將濾液重新加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，重新離心一次。⑤向ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中加入７００⑥重復(fù)步驟⑤一次。⑦將Ｓｐｉｎ⑧將Ｓｐｉｎ⑨ｒｔＬＢｕｆｆｅｒＷＢ，１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１Ｃｏｌｕｍｎ安置于ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ上，１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｍｉｎ。Ｃｏｌｕｍｎ安置于新的１．５ｍＬ離心管中，室溫靜置３－４ｍｉｎ，晾干ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中的乙醇。向ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ膜的中央加入３０ｌｌＬ雙蒸水或ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ，室溫靜置１ｍｉｎ。０００⑩１２２．３．４ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ，洗脫ＤＮＡ。ｐＰｌＣ９Ｋ載體與目的基因的連接將回收的ｐＰＩＣ９Ｋ載體與蛋白酶Ｋ基因連接，連接體系如下：表２．４蛋白酶Ｋ與ｐＰＩＣ９Ｋ連接體系Ｔａｂ．２．４ＬｉｇａｔｅｓｙｓｔｅｍｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫａｎｄｐＰＩＣ９Ｋ成分１０×ｌｉｇａｔｅＢｕｆｆｅｒＴ４ＤＮＡｌｉｇａｔｅ體積１１３１ｌＬｌｌＬ１１ＬｐＰＩＣ９Ｋ載體蛋白酶Ｋ目的基因５ｇＬ將上述物質(zhì)加入到０．５ｍＬ離心管中，混勻。于１６。Ｃ連接過夜。２．３．５￡ｃｏｌ，０８５Ｑ感受態(tài)的制備①用接種針挑取大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ菌液，在ＬＢ固體培養(yǎng)基中劃線。置于３７℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。②挑取大腸桿菌ＤＨＳａ單菌落接種于ＬＢ液體培養(yǎng)基中。３７。Ｃ，１７０ｒｐｍ振蕩培養(yǎng)過夜。③將菌液按１％接種于５０ｍＬＬＢ液體培養(yǎng)基中，３７℃，１７０ｒｐｍ振蕩培養(yǎng)至ＯＤ６００為０．２－０．４。④無菌條件下將菌液分裝至５０ｍＬ離心管中，冰上放置３０ｍｉｎ，使其徹底低溫。４℃，２０００—２２００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄上清，倒置１ｍｉｎ，使培養(yǎng)基流盡。大連理：ｊ：大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文⑤向菌體中加入３０ｍＬ預(yù)冷的０．１ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２溶液，懸浮菌體，置于冰上冰?。常埃恚椋?。⑥４℃，２０００－２２００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，棄上清．再次加入２ｍＬ預(yù)冷的０．１ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２溶液和２ｍＬ５０％甘油，混勻后每２００ｐＬ一管分裝至１．５ｍＬ離心管中，一８０℃保存?zhèn)溆?。２．３．６連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化及鑒定（１）連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化利用熱激法將ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化ＤＨ５ａ感受態(tài)細(xì)胞，具體操作如下：①所有的連接產(chǎn)物都加入到２００ｌｌＬ感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰?。常埃恚椋?。②置于４２℃中熱激６０－９０ｓ，立即放于冰上冰?。玻恚椋?。③無菌條件下向轉(zhuǎn)化體系中加入１ｍＬ無抗性的ＬＢ培養(yǎng)基，混勻后置于３７℃搖床中，振蕩培養(yǎng)１．５ｈ。④４０００ｒ／ｍｉｎ離心３ｍｉｎ，棄掉８００ｌｌＬ上清，將剩余的上清及菌體吹打混勻后涂布到含有１００ｍｇ／ｍＬ氨芐青霉素的ＬＢ固體培養(yǎng)基中，置于３７℃恒溫箱中培養(yǎng)過夜。（２）質(zhì)粒ＤＮＡ的提取從長出菌落的ＬＢ固體培養(yǎng)基中挑取單茵落接種于含有１００ｍｇ／ｍＬ氨芐青霉素的ＬＢ液體培養(yǎng)基中，３７℃振蕩培養(yǎng)過夜。利用質(zhì)粒小提試劑盒中的方法進(jìn)行質(zhì)粒ＤＮＡ的提取。步驟如下：①柱平衡步驟：向吸附柱ＣＰ３中加入５００ｌｌＬ平衡液ＢＬ，１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｍｉｎ。倒掉收集管中的濾液，將吸附柱重新放回收集管中。②?。保恚踢^夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｍｉｎ。盡量吸去上清。③向菌體中加入２５０ｌｌＬ溶液Ｐ１（已加入ＲＮａｓｅ），吹打懸浮菌體。④向離心管中加入２５０ｌｌＬ溶液Ｐ２，溫和的上下翻轉(zhuǎn)６—８次使菌體充分裂解。⑤向離心管中加入３５０ｌｌＬ溶液Ｐ３，立即上下翻轉(zhuǎn)６－８次，充分混勻，此時(shí)將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１５ｍｉｎ。⑥將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱ＣＰ３中，１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｒａｉｎ，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。⑦向吸附柱中加入６００ｌａＬ溶液ＰＷ（已加入乙醇），１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｍｉｎ。倒掉廢液。⑧重復(fù)步驟⑦。蚩白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化⑨將吸附柱放回收集管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ。⑩將吸附柱放到一新的離心管中，靜置３－４ｍｉｎ。向吸附柱膜的中央加６０ｌｌＬ無菌水或ＥＢ緩沖液。室溫靜置２－３ｍｉｎ。１２（３）限制性內(nèi)切酶酶切鑒定用ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ兩種限制性內(nèi)切酶對提取的質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。酶切體系如下：０００ｒ／ｍｉｎ離心２ｍｉｎ。表２．５Ｔａｂ．２．５ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒雙酶切鑒定體系ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ成分質(zhì)粒ＥｃｏＲＩ體積１０ｌｌＬ０．５皿０．５ｐＬ２ｐＬ２ｐＬＮｏｔＩ１０×ＨＢＳＡｄｄＨ２０５１ｌＬ將上述物質(zhì)加入到０．５ｍＬ離心管中，混勻后，３７。Ｃ放置６—７ｈ。２．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論２．４．１優(yōu)化后蛋白酶Ｋ密碼子序列利用密碼子優(yōu)化軟件（ｈｔｔｐ：／／ｇｃｕａ．ｓｃｈｏｅｘｉｌ．ｄｅ／）對ＧｅｎＢａｎｋ中蛋白酶Ｋ基因序Ｎ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ０３１２７２．１１進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蛋白酶Ｋ基因中有多處是畢赤酵母的稀有密碼子，其中有１１處是極稀有密碼子。利用密碼子優(yōu)化軟件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ／）對蛋白酶Ｋ基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在不改變氨基酸序列的前提下，獲得優(yōu)化后的蛋白酶Ｋ的基因序列。基因序列如下：大連理．Ｊ：大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩十學(xué)位論文．－－Ｔ：ＣＡＧ：Ｔ０：：Ｓ；國：五．醯０Ａ：嗇ｏＡＡＧ囂５：：ｏ一－－ＡＴＴ暑；。：０３ＡＡ３：：ＡＳＡ０３：Ｇ矗Ａ矗：ＳＳ?。菏睿铮乎担簭?qiáng)復(fù)Ａ：Ａ：：０：：ＡＡｇ：Ｔ：；溶Ｇ鑫Ａ玨ｇ五：ｒ鑫：咒ＴＧ：：：ｏｏ搿占口ＡＹＡＡ五ＮＶ甚Ｚ孓ＶＡＺ五Ａ鑫Ａｏ暑∞Ｇ∞Ａ工ＳｅＡＡＡＡ６醵∞口ｇ∞ＡＡＧＣｏＡ舀ＡＣ強(qiáng)ｏＧ：工：ＡｏＡＡＧＡＡｏｇｒｒｒＴ：ｒ：：ｇｇＴ：了Ｃ３囂Ｇｏ：Ａ∞＿ｒＴＧＧＡ０３ＡＡＡＡＣＡＴＧＧ：曙ＡＧＡＧ：：口ＧＡＧＡＧＣ工ＣＡＣ：￡ＡＢＡＣＧ：？工Ｍ蓋ＭＡＹ量ＺＡ：Ｎ五ＡＫＭｚＶＹＲ￡ＶＧＡ五工Ａｏ訂：ＧＡＡｏＡＡＧＡ：３０：ＧｒｒＧｒＺＡ：?。粒悯担茫牵茫颍谴＃茫粒粒羾蹋粒粒茫樱锕ぃ铮呼唬牵铮模危郑郑遥危裕冢伲遥牵郑粒模郑祝牵樱颍颍海鞘睿铩辏粒叮粒潦浚茫裕苗唷蓿粒纾海浴蓿铮海粒牵鐝?qiáng)唧Ｃ強(qiáng)ＣｎＡｏｒＡｏ：Ａｏ強(qiáng)ＣＧＡＡ芏：了Ｙ：０Ｄ五Ｖ工ＡＮＹＬＤＡＡＧＣＴ５ＧＴｏＡＡＧＧＴＴＣｎＧｒＧｒｒｒＡＣｇｒＺ玎Ｃ６ＡＣＡＣｒＧＧＺＡｒＣＧＡＡＧＣｒｒＴＧ強(qiáng)ｏｏＡＡＧＡｏＡＡＲＧＤＹＹ￡ＹＴＴｏＧＡＡＧＧＴＡＧ矗５ＣＴＣＡＡＡ工ＧＧｒ！ＡＡ￡通Ｃｒ：ＡＣ了ＡＣＴＡＣｚＣ，叮ＣＴＡＧＡ強(qiáng)ＣＳＧｒＡＡＣＧｇｒＣＡＣ５ＧＺＡＣｒＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧ強(qiáng)口Ｇ玎ＧＧＴＴＣｔＡ＝ＧＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＧｒ！ＧＣＺＡＡＧＡＡＧＡＣ士ＱＧ？ＣＶＭＧＶＹＶＸＶＡＲ甚Ｑ、ＥＮＸＲＡＣｖｏＡＶ？ｔＧＤＹ￡囊Ａ訂Ｇ訂ＣＧｌＥ；ｒＧＴＴＡ甬，．ＣｖＧｒＩ＇Ｔ＇Ｉ－ＩＧＧＡＣＧＡＣ晝五ＣＧＧ靠Ｃ工屯麗ＣＡＡｚＡＣＴＣｌＡＣｌ麓３ｔ：ＡｒＣＬＱＧＣＴｏＧ昱丑ＹＧＧ口ＶＫＴ＿矗？ＧＧＡＣｒＴＣＧｒｒｃ；Ｃ玎ＣＴＧＡｏＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＡｃｚｃ囂ＣＣＡＡＡＧＧＧ?。顷伲牵海伞牵郑郑粒停模疲郑粒模耍危龋遥危耍牵茫怨ぃ茫裕裕裕牵颍茫。裕裕牵强冢牵牵裕牵牵裕裕粒茫裕茫裕裕苗啵茫裕牵簦粒粒茫裕茫裕牵茫颍牵茫裕牵茫簦粒囚裕牵牵蹋危伲茫廖澹荩颍茫颍颍茫裕牵牵裕牵粤耸砹耍牵牵裕裕牵茫裕牵颍裕牵茫裕牵茫裕牵牵冢粒粒茫粒粒茫粒粒茫牵茫裕牵粒茫牵霉ぃ粒牵刘担茫颍粒茫裕茫颍茫茫粒牵苗啵霉ぃ谴＃粒谩辏凉ぃ茫裕牵颍蚬ぃ牵裕量冢牵蜍叮牵牵裕牵茫睿茫浚牵粒茫粒牵凉ぃ粒茫牵粒茫粒妫唬粒粒牵凉ぃ茫В疲裕茫裕裕裕茫裕密叮粒粒茫冢粒茫牵牵颍颍茫颍牵颍颍颍裕牵牵粒茫?？ＣｒｒＣＧ甜ＣＣ＾ＧＧ工ＡＣＴＧＡＣＡ：ｒＣｒ？ＧｚＣＴＡＣ前ＧＧ矗工ＣＧＧＴＧＧ訂ＣＴＡＣ：盈＿Ｇ函ＺＣ：Ｔｊ口ＣＴＣｒＧＧＺＡＣＴ?。茫冢潦浚牵牵茫裕粒茫簦茫茫粒遥蹋量冢伲蹋牵停牛福觯担粒郑危牵危危粒粒粒模粒粒粒遥遥牵粒疲祝牵觯觯郑粒粒裕蹋牵郑模危模遥危遥茫伲牵粒裕龋叮郑遥停疲墓ぃ茫粒茫恚牵铮颍牵牵蚨×耍牵牵茫裕牵茫蚬ぃ粒茫蚬ぃ歉鳎颍牵粒铮颍颍颍牵牵牵裕海粒粒抢玻粒悖颍牵昧耍牵茫颍颍茫颍牵茫汗すぃ粒伲蹋牵枪すぃ停粒粒。牵冢粒牵凉ぃ粒茫粒茫牵茫颍叮粒茫粒茫裕牵茫裕粒粒茫粒粒牵牵牵裕牵粒茫裕裕牵颍茫冢粒痢牯茫埃埃羚啵茫牵牵裕粒茫海颍牛郑遥危蹋粒粒粒模伲伲蹋危伲冢牵粒蹋模牛牵耍粒校粒牵裕粒粒茫炜冢恰苛?xí)｝ｖ囡Ｌ工．ＧＧｃＴｒＡｃＡＡｃＡＡｏ嫩ｃｍｃｒｃＫＧ虻｝ｃＡｃ強(qiáng)ｃ∞ｃＡ‰砷ｊ：ＧＧｃｃＩ·－暑—＿五一Ｆ．互Ｎ口Ｅ丑丑丑基ＡＫｓ囂圖２．１優(yōu)化后蛋白酶Ｋ基因序列Ｆｉｇ．２．１ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｏｎｓ注：方框內(nèi)序列分別為ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ酶切位點(diǎn)，劃線部分為六個(gè)組氨酸標(biāo)簽在這段優(yōu)化的密碼子序列中，保持氨基酸序列不變的情況下，共替換了２４７個(gè)堿基，優(yōu)化后的密碼子序列幾乎全部是畢赤酵母的偏愛密碼子。由于密碼子序列對外源蛋白的表達(dá)量具有很大的影響，稀有密碼子的存在會導(dǎo)致外源蛋自表達(dá)量降低甚至不表達(dá)，所以通過優(yōu)化外源基因密碼子序列提高蛋白表達(dá)量己成為一種高效表達(dá)的常用手段。密碼子優(yōu)化方法有多種，如定點(diǎn)突變技術(shù)、分段ＰＣＲ擴(kuò)增技術(shù)及人工合成技術(shù)等。人工合成技術(shù)簡便、快速、突變率低，尤其實(shí)用于稀有密碼子較多的序列。本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化后的密碼子序列的前后兩端分別加上ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ兩種限制性酶切位點(diǎn)。為了利用親和層析的方法進(jìn)行純化，在基因序列的Ｃ端加上了六個(gè)組氨酸標(biāo)簽。蛋白酶Ｋ基因的Ｎ端含有信號肽，在蛋白酶Ｋ成熟分泌到胞外的過程中，信號肽被切除，為了避免組氨酸標(biāo)簽被切除，應(yīng)該將組氨酸標(biāo)簽加在蛋白酶Ｋ的Ｃ端。２．４．２ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定（１）ｐＰＩＣ９Ｋ載體及目的基因的雙酶切．２１．蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化利用ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ兩種限制性內(nèi)切酶分別對ｐＰＩＣ９Ｋ載體及ＰＵＣ５７Ｔ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。酶切結(jié)果如圖２．２：圖２．２Ｆｉｇ．２．２ｐＰＩＣ９Ｋ載體及ＰＵＣ５７Ｔ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒雙酶切圖ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９ＫａｎｄＰＵＣ５７Ｔ－ＰｒｏＫ１：ｐＰＩＣ９Ｋ質(zhì)粒２：經(jīng)ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ酶切的ｐＰＩＣ９Ｋ質(zhì)粒Ｂ：Ｍ：ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ１：ＰＵＣ５７Ｔ—ＰｒｏＫ質(zhì)粒２：經(jīng)ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ酶切的ＰＵＣ５７Ｔ．ＰｒｏＫ質(zhì)粒Ａ：Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ（２）將回收的ｐＰＩＣ９Ｋ載體與目的基因連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ＤＨ５ａ，挑取單菌落提取質(zhì)粒，做酶切鑒定。酶切結(jié)果如圖２．３所示：Ｖｌ二Ｉ２０００ｂｌｉ０００ｂｒ圖２．３重組質(zhì)粒ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ的酶切驗(yàn)證鑒定Ｆｉｇ．２．３ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩＭ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒｌ：ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒２：雙酶切ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒３：雙酶切ｐＰＩＣ９Ｋ質(zhì)粒．２２．大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文從圖中可以看出，提取的質(zhì)粒可以通過雙酶切切出１２００ｂｐ大小的蛋白酶Ｋ基因，說明蛋白酶Ｋ目的基因已經(jīng)連接到ｐＰＩＣ９Ｋ載體上。ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒構(gòu)建正確。ｐＰＩＣ９Ｋ載體是一種分泌型酵母表達(dá)載體，利用該載體可以實(shí)現(xiàn)外源基因在酵母中的分泌表達(dá)。并且蛋白酶Ｋ本身是一種分泌蛋白，分泌表達(dá)有助于蛋白酶Ｋ正確的加工修飾。由于畢赤酵母本身分泌很少的蛋白，雜蛋白少，外源基因的分泌表達(dá)大大簡化了后期的分離純化工藝。２．５?。Y(jié)１．利用密碼子優(yōu)化軟件對蛋白酶Ｋ基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，使其成為畢赤酵母的偏愛密碼子，通過基因合成手段，獲得優(yōu)化后的蛋白酶Ｋ基因。２．將蛋白酶Ｋ基因連接到ｐＰＩＣ９Ｋ載體上，構(gòu)建了ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ酵母表達(dá)載體。蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化３３．１蛋白酶Ｋ在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及條件優(yōu)化前言畢赤酵母的發(fā)酵條件對產(chǎn)物的表達(dá)量具有較大的影響。不同外源蛋白所需的表達(dá)條件也有很大的差別，所以在進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化可以明顯提高產(chǎn)物表達(dá)量。本章將前面構(gòu)建好的ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ酵母表達(dá)載體利用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，實(shí)現(xiàn)了蛋白酶Ｋ在酵母中的分泌表達(dá)。利用搖瓶發(fā)酵對發(fā)酵時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、ｐＨ、誘導(dǎo)劑濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化。利用優(yōu)化的條件進(jìn)行５Ｌ發(fā)酵罐發(fā)酵，蛋白酶Ｋ表達(dá)量可以達(dá)到２．２ｇ／Ｌ發(fā)酵液。３．２實(shí)驗(yàn)材料與試劑３．２．１材料與試劑畢赤酵母ＧＳｌｌ５Ｄ．山梨醇三氯乙酸（ＴＣＡ）本實(shí)驗(yàn)室保存上海生工生物工程股份有限公司上海生工生物工程股份有限公司北京索萊寶科技有限公司ＭｅｒｃＫ公司上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司ＳＩＧＭＡ公司ＢＣＡ蛋白定量試劑盒Ｈｉｓ－ＮＴＡ親和層析柱９６孔板偶氮酪蛋白甘油甲醇天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司天津博迪化工股份有限公司ＥＣＬ顯色試劑盒鼠源抗Ｈｉｓ—Ｔａｇ抗體ＨＲＰ標(biāo)記的羊抗鼠ＩＧｇ上海生工生物工程股份有限公司上海生工生物工程股份有限公司上海生工生物工程股份有限公司３．２．２主要實(shí)驗(yàn)儀器電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)杯（０．２ｃｍ）寧波新芝Ｂｉｏ．Ｒａｄ５Ｌ發(fā)酵罐上海百侖生物科技有限公司大連理：Ｆ大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文酶標(biāo)儀美國分子儀器公司北京六一儀器廠北京六一儀器廠垂直電泳槽凝膠成像分析系統(tǒng)ＤＹＹ．２Ｃ電泳儀上海六一儀器廠上海亞榮生物儀器廠上海滬西分析儀器廠美國Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司ＴＳ．１平衡脫色搖床微型渦旋混合儀轉(zhuǎn)膜儀恒溫振蕩儀電熱恒溫培養(yǎng)箱３．２．３主要試劑及配制方法常州國華電器有限公司上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠表３．１主要溶液及配制方法Ｔａｂ．３．１Ｔｈｅｍａｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｇｎｍｅｔｈｏｄｓ試劑１０ＸＹＮＢ配制方法１３．４９ＹＮＢ溶于１００ｍＬ蒸餾水中，過濾除菌。４℃保存稱取２０ｍｇ生物素溶解于１００ｍＬ蒸餾水中，過濾除菌后，４℃保存將２００ｇ葡萄糖溶于１Ｌ水中，過濾或高壓除菌，４℃保存。１００５００×生物素１０×葡萄糖１０×甘油１Ｍ山梨醇ＹＰＤ液體培養(yǎng)基ＭＤ固體培養(yǎng)基ＢＭＭＹ培養(yǎng)墓ｍＬ甘油溶于９００ｍＬ水中，過濾除菌或高壓滅菌，４℃保存。將１８２９山梨醇溶于１Ｌ雙蒸水中，高壓滅菌。２０ｇ葡萄糖，２０ｇ蛋白胨，１０ｇ酵母提取物，加蒸餾水定容至１Ｌ。固體培養(yǎng)基需加２％的瓊脂粉。完全溶解后１２１℃滅菌１５ｍｉｎ。向８０ｍＬ水中加入２ｇ瓊脂，１２１℃滅菌２０ｒａｉｎ，待溫度降至６０℃時(shí)，在無菌條件下加入１０ｍＬ１０×ＹＮＢ，１０ｍＬ１０Ｘ葡萄糖，２００皿５００Ｘ生物素酵母提取物１０ｇ／Ｌ，蛋白胨２０ｇ／Ｌ，磷酸氫二鉀３ｇ／Ｌ，磷酸二氫鉀１１．８ｇ／Ｌ加水至８９０ｍＬ。１２１℃滅菌２０ｒａｉｎ，待溫度降至６０℃左右時(shí)無菌條件下加入１００ｍＬｌ０×ＹＮＢ，１０ｍＬ甘油，１ｍＬ５００Ｘ生物素。ＢＭＧＹ培養(yǎng)基酵母提取物１０ｇ／Ｌ，蛋白胨２０ｇ／Ｌ，磷酸氫二鉀３ｇ／Ｌ，磷酸二氫鉀１１．８ｇ／Ｌ加水至８９５ｍＬ。１２１℃滅菌２０ｍｉｎ，待溫度降至６０℃左右時(shí)無菌條件下加入１００ｍＬｌ０×ＹＮＢ，５ｍＬ甲醇，１ｍＬ５００×生物素。溶液Ａ４８ｇ丙烯酰胺，１．５ｇＮ，Ｎ一亞甲基雙丙烯酰胺，用雙蒸水定容至１００ｍＬ，室溫下完全溶解后過濾，４℃保存。溶液Ｂ７５ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌ緩沖液（ｐＨ８．８），４ｍＬＯ．１ｍｏｌ／ＬＳＤＳ，加超純水定容至１００ｍＬ溶液Ｃ５０ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液（ｐＨ６．８），４ｍＬ０．１ｍｏｌ／ＬＳＤＳ，加超純水定容至１００ｍＬ。．２５．蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化１０％過硫酸銨２×樣品緩沖液考馬斯亮藍(lán)染色液Ｔｒｉｓ．甘氨酸電泳緩沖液脫色液ＴＢＳＴ緩沖液轉(zhuǎn)膜緩沖液Ｏ．１ｇ過硫酸銨溶于１ｍＬ超純水中，完全溶解后混勻，需現(xiàn)用現(xiàn)配。Ｏ．５４ｇ１ｇ溴酚藍(lán)，５ｍＬ１ｍｏｌ／Ｌ％ｓ－ＨＣｌ緩沖液（ｐＨ６．８），１０ｍＬ甘油，５ｍＬ巰基乙醇，ＳＤＳ，加入雙蒸水定容至５０ｍＬ，過濾后４℃保存。ｇ考馬斯亮藍(lán)Ｒ－２５０，１００ｍＬ冰醋酸，２５０ｍＬ異丙醇，加單蒸水定容至６５０ｍＬ，混勻。１．２ｇＴｒｉｓ堿，５．７６ｇ甘氨酸和０．４ｇＳＤＳ，加單蒸水定容至ｌ０００ｍＬ，混勻。３００ｍＬ乙醇，１００ｍＬ乙酸，加單蒸水定容至１０００ｍＬ，混勻。８．８ｇＮａＣｌ，２０ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）加８００ｍＬ去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，加入０．５ｍＬＴｗｅｅｎ２０，加水定容到１Ｌ，４＂Ｃ保存。２．９ｇ甘氨酸、５．８ｇＴｒｉｓ．ＨＣｌ、Ｏ．３７ｇＳＤＳ溶解于８００ｍＬ去離子水中，充分?jǐn)嚢枞芙?。加入２００ｍＬ甲醇。酵母裂解液０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（．ｐＨ密．Ｏ），１％ＳＤＳ３．３?shí)驗(yàn)方法３．３．１ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒的線性化及質(zhì)粒的純化（１）質(zhì)粒的線性化按照２．３．６的方法提取ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ質(zhì)粒。由于線性化質(zhì)粒可以明顯提高質(zhì)粒與酵母基因組的同源重組效率，實(shí)驗(yàn)選用ＳａｌＩ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行線性化。酶切體系如下：表３．２Ｔａｂ．３．２ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒酶切體系ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫｐｌａｓｍｉｄ成分ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ質(zhì)粒ＳａｌＩ１０×ＨｄｄＨ２０體積３０ｐＬ３ｐＬ５ｐＬ２ｐＬ置于３７℃恒溫箱中酶切過夜。（２）線性化產(chǎn)物的純化①將酶切產(chǎn)物加滅菌水補(bǔ)足至５００ｌｌＬ體系，，加入等體積的酚／氯仿／異戊醇，振蕩混勻，１２００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ。大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文②將上清轉(zhuǎn)移至１．５ｍＬ離心管中，向溶液中加入１／１０體積的３ｍｏｌ／Ｌ的乙酸鈉（ｐＨ５．２），混勻后加入兩倍體積的無水乙醇，－８０℃放置１５ｍｉｎ或一２０℃放置３０ｍｉｎ。③１２００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，棄上清，加入１ｍＬ７０％乙醇。顛倒數(shù)次再次離心。④棄上清，徹底風(fēng)干沉淀物，向沉淀中加入３０ｌｌＬ雙蒸水溶解沉淀。３．３．２畢赤酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化（１）畢赤酵母感受態(tài)的制備①從斜面試管中取少量菌體接種于３０－５０ｍＬ液體培養(yǎng)基中，３０℃培養(yǎng)２４ｈ。②將菌液按１％一２％的量轉(zhuǎn)接至新的１００ｍＬＹＰＤ液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜。３０℃，２５０ｒ，保證通氣性良好。③測ＯＤ６００達(dá)到１．０—１．５左右，冰浴放置１５ｍｉｎ，使培養(yǎng)基徹底冷卻。此時(shí)將超純水及山梨醇均放到冰上冷卻。④將菌液分裝至無菌的５０ｍＬ離心管中，４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ，離心５ｍｉｎ，收集細(xì)胞。⑤棄上清，將離心管倒置１ｍｉｎ，使培養(yǎng)基完全流盡。向茵體中加入４０ｍＬ無菌超純水，重懸細(xì)胞。４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ，離心５ｍｉｎ，收集細(xì)胞。⑥去上清，重復(fù)⑤兩次。⑦棄上清，留菌體，向菌體中加入４０ｍＬ預(yù)冷的１ｍｏｌ／Ｌ山梨醇重懸細(xì)胞。４℃，４０００ｒ／ｒａｉｎ，離心５ｍｉｎ，收集細(xì)胞。⑧重復(fù)⑦一次。⑨棄上清，用５００ｌｌＬ１Ｍ山梨醇重懸細(xì)胞，使最終體積為１．３ｍＬ左右。注：山梨醇越少越好。⑩將做好的感受態(tài)細(xì)胞分裝至離心管中，準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)。（２）ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化①向感受態(tài)細(xì)胞中加入１０ｌｌＬ線性化的質(zhì)粒，輕輕混勻。②將感受態(tài)細(xì)胞與質(zhì)?；旌弦杭尤氲剑希玻悖淼狞c(diǎn)轉(zhuǎn)杯中，輕敲幾下，使液體沉于杯底，擦干點(diǎn)轉(zhuǎn)杯周圍的水滴，放在點(diǎn)轉(zhuǎn)儀上準(zhǔn)備電轉(zhuǎn)。③設(shè)置酵母參數(shù)，“劬西”“Ｓｃ０２”，點(diǎn)擊Ｐｕｌｓｅ。④取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入１ｍＬ冰浴的１ｍｏｌ／Ｌ的山梨醇，用移液器吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至１．５ｍＬ無菌的離心管中，３０℃靜置孵育５－７ｈ。⑤離心１ｍｉｎ。棄掉部分上清，留２００ｌｌＬ左右的上清液，吹打混勻后涂至選擇培養(yǎng)基上。蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化⑥３０℃倒置培養(yǎng)２—３天，直到長出轉(zhuǎn)化子。３．３．３高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子的篩選及ＰＣＲ鑒定（１）高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子的篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子可以提高產(chǎn)物的表達(dá)量，因?yàn)椋穑校桑茫梗溯d體上含有含氨芐青霉素和卡那霉素抗性，高拷貝的插入可以提高轉(zhuǎn)化子對Ｇ４１８的抗性，可以用Ｇ４１８篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。將在ＭＤ選擇培養(yǎng)基上生長的菌落挑到不含Ｇ４１８的ＹＰＤ平板上，并標(biāo)上號。然后將菌落依次點(diǎn)種到含不同濃度的Ｇ４１８（０．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍ咖Ｌ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍ∥ｍＬ）的ＹＰＤ培養(yǎng)板上，３０℃培養(yǎng)３—４ｄ，篩選高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子。（２）酵母基因組的提取實(shí)驗(yàn)用玻璃珠法提取酵母基因組，步驟如下：①ｒ挑取在含５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ平板上生長的菌落接種于３０ｍＬＹＰＤ液體培養(yǎng)基中，３０℃下振蕩培養(yǎng)過夜。②ｒ取１ｍＬ菌液于１．５ｍＬ離心管中，１２０００ｒ／ｍｍ離心５ｍｍ，收集細(xì)胞。③ｒ棄上清，向菌體中加入１ｍＬ無菌水，將菌體吹打起來后，同上離心，清洗細(xì)胞。④ｒ棄上清，向菌體中加入７００ｌｌＬ的裂解液，將菌體吹打懸浮。⑤ｒ向茵體中加入干凈的玻璃珠（約離心管的２／３體積）和２５ｌｌＬ的５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ。⑥ｒ利用微型渦旋混合儀振蕩１０ｍｉｎ。１２０００ｒ／ｍｍ離心２ｍｍ。⑦ｒ?qū)⑸锨逡恨D(zhuǎn)移至新的１．５ｍＬ離心管中⑧ｒ加入等體積的苯酚／氯仿／異戊醇（２５：２４：１），高速振蕩５ｒａｉｎ，１２０００ｒ／ｍｍ離心５ｍｉｎ，抽提ＤＮＡ。⑨ｒ取上清，向上清液中加入１ｍＬ預(yù)冷的無水乙醇，一８０℃下沉淀３０ｍｉｎ。⑩ｒ１２０００ｒ／ｍｍ離心５ｍｍ，棄上清，向沉淀中加入７０％乙醇清洗兩次。⑨ｒ１２０００ｒ／ｍｍ離心２ｍｍ，棄上清，將沉淀徹底晾干后，向沉淀中加入５０ｌｌＬｌ衛(wèi)緩沖液。提取的基因組通過１％瓊脂糖凝膠電泳分析提取效果。（３）轉(zhuǎn)化子的ＰＣＲ鑒定大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩十學(xué)位論文挑取在５ｒａｇ／ｍＥＧ４１８濃度的ＹＰＤ平板上生長的陽性轉(zhuǎn)化子菌株及空載ｐＰＩＣ９Ｋ轉(zhuǎn)化的菌落接種在不含抗生素的ＹＰＤ液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到一定濃度后利用上述方法提取酵母基因組。用ｐＰＩＣ９Ｋ載體的通用引物進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增。引物序列如下：ＡＯＸ－Ｆ：ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣ從ＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＯＸ—Ｒ：ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ轉(zhuǎn)化子ＰＣＲ反應(yīng)體系如下：ｌＯ×ｂｕｆｆｅｒｄＮＴＰ２１．ｔＬ２ｌａＬ０．２ｐＬ１ＵＬｌ１ＵｐＭｉｘｔｕｒｅＬＡＴａｑＡＯＸ—ＦＡＯＸ—ＲＬＬｕ陽性轉(zhuǎn)化子基因組ｄｄＨ２０定容到２０ＬｐＰＩＣ９Ｋ空載體轉(zhuǎn)化子ＰＣＲ擴(kuò)增體系：１０×ｂｕｆｆｅｒｄＮＴＰ套ｍｘｔｕｒｅＬＡＴａｑＡＯＸ．ＦＡＯＸ二Ｒ２２ＬＬＵＵＯ．２ＵＬ１ＩｌＬ１ＵＬｌＵＬ陰性轉(zhuǎn)化子基因組ｄｄＩ－１２０定容到２０ｕＬ反應(yīng)條件如下：９４℃９４℃６０℃７２℃７２℃１６℃鼬ｍ．１ｎｍ．１ｎＯＳｍ．１ｎｏ厶ＬｆｕＣｙＣｅＳ協(xié)∞孫ｃ曼ｍ．１ｏ∞、ｌＬｒｊｎ通過１％瓊脂糖凝膠電泳分析ＰＣＲ效果。３．３．４蛋白酶Ｋ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳鑒定及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析．２９．蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化（１）蛋白酶Ｋ的誘導(dǎo)表達(dá)將經(jīng)過ＰＣＲ鑒定正確的菌落接種到３５ｍＬＢＭＧＹ培養(yǎng)基中（２５０ｍＬ搖瓶），進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)挑取一株空載體轉(zhuǎn)化子作為對照進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，具體步驟如下：①挑取單菌落接種至３０ｍＬＹＰＤ培養(yǎng)基中，２８℃一３０℃，２２０ｒ，振蕩培養(yǎng)１６—１８０Ｄ６００＝４—６。ｈ，②將菌液接種于３５ｍＬＢＭＧＹ培養(yǎng)基中（２５０ｍＬ搖瓶），２８＂Ｃ一３０℃，２２０ｒ，振蕩培養(yǎng)１６—１８ｈ，０Ｄ６００＝２—６。③５０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，棄上清，收集細(xì)胞。用２００ｍＬＢＭＭＹ培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接入１Ｌ搖瓶中，用４層紗布封口。２８—３０℃，２２０ｒ振蕩培養(yǎng)。每２４ｈ補(bǔ)加１００％甲醇至終濃度為０．５％。④定期取樣，１２測。０００ｒ離心５ｒａｉｎ，去茵體，上清用于酶活測定和ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳檢（２）ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳分析由于蛋白酶Ｋ分泌到培養(yǎng)基中，濃度較低，直接進(jìn)行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳不易觀察到條帶，需要對樣品進(jìn)行濃縮。樣品濃縮的方法有多種，本實(shí)驗(yàn)利用三氯乙酸（ＴＣＡ）沉淀法對樣品進(jìn)行濃縮。實(shí)驗(yàn)方法如下：①ｒ取菌液１２０００ｒ／ｍｉｎ，離心５ｍｉｎ，收集表達(dá)上清。②ｒ取５００．１０００ｕＬ上清于ＥＰ管中，加入１／１０體積的１００％ＴＣＡ，顛倒１０次混勻。③ｒ樣品冰浴大于０．５ｈ，過夜效果更好。④ｒ１２０００ｒ／ｍｉｎ，離心１０．２０ｍｉｎ，可見有棕黑色沉淀，倒掉上清，將ＥＰ管倒扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去殘余在管口的液體。⑤ｒ加入２００ｕＬ冰冷的丙酮，用手指輕彈ＥＰ管，洗去管底和管壁殘余的ＴＣＡ。⑥ｒ１５０００９，離心１０—２０分鐘，倒掉上清，將ＥＰ管倒扣在吸水紙上輕輕控幾下，除去ｂｕｆｆｅｒ，９５＂ｃａｎ熱１０ｍｉｎ，一般沉淀會自動溶解，如果不殘余在管口的液體。⑦ｒ加入２０－－５０ｕＬＬｏａｄｉｎｇ溶，用手指輕彈管壁或用２０ｕＬ槍頭輕輕吸打，注意整個(gè)操作盡量不要碰到管壁，因?yàn)楣鼙诳赡苷从袣堄啵裕茫?。ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳步驟如下：①凝膠的制備實(shí)驗(yàn)采用１２％的分離膠及４％的濃縮膠體系，具體成分如下：１５ｍＬ１２％分離膠的制備：大連理ｊＩ：大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文ｄｄＨ２０４．９ｍＬ３０％單丙烯酰胺６．０ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ６．８１３．８ｍＬ１０％ＳＤＳ０．１５ｍＬ１０％過硫酸銨０．１５ｍＬＴＥＭ匣Ｄ０．００６ｍＬ將上述溶液充分混勻后加入制膠器中，約７ｍＬ，然后向制膠器中加入約ｌｍＬ的雙蒸水，壓平膠面。待分離膠完全凝固后，將水層倒出并用濾紙完全吸干。５ｍＬ５％濃縮膠的制備：ｄ姐２０３．４ｍＬ３０％單丙烯酰胺０．８３ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．６３ｍＬ１０％ＳＤＳ０．０５ｍＬ１０％過硫酸銨０．０５ｍＬＴＥＭＥＤ０．００５ｍＬ將上述溶液完全混勻后加入制膠器中，插入梳子，待濃縮膠完全凝固后，拔出梳子即可進(jìn)行電泳。②電泳：將凝固好的膠放入電泳槽中，加入１×電泳緩沖液，利用微量上樣器上樣。打開電源，將電壓設(shè)為７５Ｖ，帶樣品被濃縮成一條直線時(shí)，將電壓調(diào)為１５０Ｖ，電泳１．５—２ｈ。③染色待電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入染色盤中，加入考馬斯亮藍(lán)染色液，染色２ｈ左右。④脫色待膠染色完畢后，回收考馬斯亮藍(lán)染色液，加入脫色液，置于平衡搖床上進(jìn)行脫色。每３０ｍｉｎ換一次脫色液，直到條帶變得清晰可見為止。（３）ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析①將蛋白酶Ｋ樣品進(jìn)行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳，方法如３．３．４所述。②ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳結(jié)束后，將膠塊取下并進(jìn)行適當(dāng)修剪。用單蒸水沖洗干凈。③根據(jù)膠塊大小剪切適當(dāng)大小的ＰＶＤＦ膜。⑤將ＰＶＤＦ膜在甲醇中侵泡２ｍｉｎ，然后置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中放置３０ｍｉｎ。⑥將濾紙板在轉(zhuǎn)膜緩沖中侵泡一下，置于轉(zhuǎn)膜儀工作面板上，排除氣泡。然后依次放上ＰＶＤＦ膜和膠塊，排除ＰＶＤＦ膜和膠塊之間的氣泡。最后放上濾紙板，加緊。⑦在１００Ｖ電壓下轉(zhuǎn)膜４０ｍｉｎ。蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化⑧轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜在ＴＢＳＴ溶液中沖洗一下，然后用５％的奶粉封閉１ｈ。⑨用５％奶粉按１：１０００稀釋鼠源抗ＨｉｓＴａｇ抗體，將稀釋后的抗體與ＰＶＤＦ膜進(jìn)行雜交１ｈ。雜交結(jié)束后，取出膜用ＴＢＳＴ清洗３次，每次１０ｍｉｎ。⑩用５％奶粉按１：２０００稀釋二抗（ＨＲＰ標(biāo)記的羊抗鼠ＩＧｇ），將二抗與ＰＶＤＦ膜雜交ｌｈ。雜交結(jié)束后，取出膜用ＴＢＳＴ清洗３次，每次１０ｍｍ。⑩將ＥＣＬ顯色劑的Ａ、Ｂ液按１：１混合，加到ＰＶＤＦ膜上顯色２ｍｉｎ。將ＰＶＤＦ膜用保鮮膜包住放入曝光盒中。在暗室中把膠片放入曝光盒中曝光２ｍｍ。取出膠片置于顯影液中２ｍｍ，漂洗一下，置于定影液中２ｍｍ。將膠片沖洗干凈，晾干。３．３．５蛋白酶Ｋ活性測定利用王輝嵋７１等蛋白酶活性測定方法，用偶氮酪蛋白（Ａｚｏｃ痢ｎ）作為底物測定蛋白酶活性。其原理為，在酶的作用下偶氮酪蛋白會釋放發(fā)光團(tuán)，通過分光光度法，在３４５處可以定量測定蛋白酶的活性。步驟如下：Ｉｌｎｌ①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用蒸餾水將成品蛋白酶Ｋ酶粉配制成２０Ｕ／ｍＬ的標(biāo)準(zhǔn)酶液，按表３．３加入以下物質(zhì)，混勻后于３７℃靜止２ｈ。向０－１０組中依次加入１００ｐＬ混勻后室溫靜止３０處測定吸光值。表３．３標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制Ｔａｂ．３．３ＴｈｅｄｒａｗｉｎｇｏｆｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅＴＣＡ，ｎｎｌｍｉｎ。１２０００ｒ／ｍｍ離心１０ｍｍ，取上清，用酶標(biāo)儀在３４５②發(fā)酵液酶活測定實(shí)驗(yàn)組將５０此２％偶氮酪蛋白溶液和２０止稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵液上清混勻，３７℃保溫２ｈ。加入１００ｇＬ三氯乙酸溶液（Ｏ．４ｍｏｌ／Ｌ），混勻后靜置３０ｍｍ。離心（１２０００ｒ／ｍｍ，１０ｍｍ），取上清，用酶標(biāo)儀在３４５ｎ／ｌ＇ｌ處測定吸光值。對照組為發(fā)酵液ｌｌＬ中先加入１００“Ｌ三氯乙酸，靜置１０ｍｍ后，再加入５０２％偶氮酪蛋白溶液，其大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文余操作同上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出發(fā)酵液中蛋白酶Ｋ的活性，計(jì)算出的活性與稀釋倍數(shù)的乘積就是蛋白酶Ｋ的酶活性。４５４３５３導(dǎo)ｎ《２５２ｌ５／１０．Ｓ二０一一～～～…～一一～～…ｒ一０２４６８１０１２１４１６酶活性（Ｕ／ｍＥ）圖３：１酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Ｆｉｇ．３．１Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ３．３．６搖瓶中蛋白酶Ｋ表達(dá)條件的優(yōu)化將重組畢赤酵母陽性轉(zhuǎn)化子甘油菌接種到３０ｍＬＹＰＤ培養(yǎng)基中，３０℃，２００ｒ振蕩培養(yǎng)至０１）６００為４－６之間。將菌液接種到ＢＭＧＹ培養(yǎng)基中，３０。Ｃ，２００ｒ振蕩培養(yǎng)至００６００為２－６之間。無菌條件下，５０００ｒ／ｍｉｎ離心５ｍｉｎ，棄上清，用５０ｍＬＢＭＭＹ培養(yǎng)基懸浮菌體，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。（１）誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化菌種接種到ＢＭＭＹ培養(yǎng)基中，２８℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，每天補(bǔ)加０．５％甲醇，定時(shí)取樣，通過測定樣品中蛋白酶Ｋ的活性，確定最佳誘導(dǎo)時(shí)間。（２）誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化菌體接種到ＢＭＭＹ培養(yǎng)基中后，分別在２０℃、２５℃、３０℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，每２４ｈ補(bǔ)加Ｏ．５％甲醇，定時(shí)取樣。通過測定樣品中蛋白酶Ｋ的活性，確定最佳誘導(dǎo)溫度。（３）誘導(dǎo)ｐＨ的優(yōu)化蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化將茵體接種到不同ｐＨ（３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．Ｏ）的ＢＭＭＹ培養(yǎng)基中，每天補(bǔ)加Ｏ．５％甲醇，定時(shí)取樣，通過測定樣品中蛋白酶Ｋ的活性，確定誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳ｐＨ。（４）誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化將菌體接種到ＢＭＭＹ培養(yǎng)基中，每天補(bǔ)加不同濃度的甲醇（０．５％、０．７５％、１％、１．２５％、１．５％）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，定時(shí)取樣，通過測定蛋白酶Ｋ的酶活性，確定最佳的誘導(dǎo)劑濃度。３．３．７發(fā)酵罐中蛋白酶Ｋ的誘導(dǎo)表達(dá)及濃度測定（１）發(fā)酵罐培養(yǎng)蛋白酶Ｋ的表達(dá)利用搖瓶優(yōu)化的表達(dá)條件對重組畢赤酵母進(jìn)行５Ｌ發(fā)酵罐發(fā)酵，并測定菌體生長曲線。用溶氧偶聯(lián)法控制甲醇流加量，并用氣象色譜檢測發(fā)酵過程中的甲醇濃度。根據(jù)搖瓶培養(yǎng)優(yōu)化的培養(yǎng)條件，發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中，菌體生長階段溫度控制在２８℃，誘導(dǎo)表達(dá)階段溫度控制在２５℃，整個(gè)發(fā)酵過程中ｐＨ控制在７．０。上罐發(fā)酵培養(yǎng)基一般采用基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基（ＢＳＭ）。基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基主要成分為一些無機(jī)鹽，對酵母菌生長會有一定限制。本實(shí)驗(yàn)嘗試采用ＢＭＧＹ／ＢＭＭＹ培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵。為了降低成本，培養(yǎng)基中沒有添加無氨基酵母氮源ＹＮＢ（ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅｗｉｔｈｏｕｔＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ），但需向培養(yǎng)基中多加入一些生物素，并用５０％氨水和５０％磷酸調(diào)節(jié)ｐＨ，氨水還可以作為酵母生長的氮源。這種培養(yǎng)基也得到了很好的表達(dá)效果。（２）ＢＣＡ法測定蛋白酶Ｋ的濃度發(fā)酵結(jié)束后，利用ＢＣＡ法測定蛋白酶Ｋ的濃度。測定方法如下：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：①根據(jù)樣品數(shù)量，ＢＣＡ試劑Ａ液與試劑Ｂ液按５０：１的比例配制適量ＢＣＡ工作液，充分混勻。ＢＣＡ工作液室溫２４ｈ內(nèi)穩(wěn)定。②用ＰＢＳ稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，?。欤洗讼♂屩粒保埃爸?，使終濃度為Ｏ．５足到２０山。⑤各孔加入２００此ＢＣＡ工作液，３７℃放置３０標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖３．１所示。ｍｉｎ。ｍｇ／ｍｌ。③將標(biāo)準(zhǔn)品按０，１，２，４，８，１２，１６，２０此加到９６孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加ＰＢＳ緩沖液補(bǔ)⑥利用酶標(biāo)儀測定Ａ弱。處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。大連理：＝ｌ二大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩十學(xué)位論文０．１６Ｏ·１４０．１２繭《０－０８０·０６０·０４０．０２０．２０．３０．４０．５蛋白濃度（ｍｇ／ｍＬ）圖３．２Ｆｉｇ．３．２ＢＣＡ法測定蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ樣品中蛋白酶Ｋ濃度的測定：陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液及陰性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液經(jīng)１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１０ｍｉｎ，收集上清，用ｐＬＰＢＳ緩沖液稀釋到合適的濃度，取２０此加入９６孔板中，再加入２００ＢＣＡ工作液，于３７℃溫育３０ｍｉｎ，在５６２ｌｌｉｎ處測定吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出陽性轉(zhuǎn)化子及陰性轉(zhuǎn)化子中的蛋白濃度。蛋白酶Ｋ的濃度即陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液中的蛋白濃度與陰性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液中蛋白濃度之差。３．４實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論３．４．１畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化及陽性高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選（１）畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)化方式有多種，如ＬｉＣｌ法、原生質(zhì)法、電轉(zhuǎn)化法等。其中電轉(zhuǎn)化法效率最高，并且操作簡單，但出現(xiàn)假陽性的概率較高，所以還要通過抗性篩選及ＰＣＲ鑒定等。在轉(zhuǎn)化之前先將質(zhì)粒線性化有助于基因的同源重組，可以大大提高轉(zhuǎn)化效率，實(shí)驗(yàn)中曾嘗試用沒有線性化的質(zhì)粒及線性化的質(zhì)粒分別做轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，后者的轉(zhuǎn)化效率是前者的數(shù)十倍甚至上百倍。線性化后的質(zhì)粒中含有其他的雜質(zhì)，會影響畢赤酵母的轉(zhuǎn)化，所以要對線性化的質(zhì)粒進(jìn)行純化。實(shí)驗(yàn)中嘗試了利用酚／氯仿／異戊醇抽提法及膠回收試劑盒純化法進(jìn)行線性化質(zhì)粒純化，均得到了較好的純化效果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒的濃度及純度對轉(zhuǎn)化效率有很大的影響，當(dāng)質(zhì)粒濃度及純度較高時(shí)，可以明顯提高畢赤酵母的轉(zhuǎn)化效率。（２）高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化將在ＭＤ組氨酸缺陷型的選擇培養(yǎng)基上生長的菌落先挑到不含Ｇ４１８抗生素的ＹＰＤ平板上并編號如圖３．３Ａ，共２００個(gè)菌落。然后將這些菌落依次點(diǎn)種到含有Ｏ．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ平板上，在含５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ平板上生長出了１７個(gè)菌落，如圖３．３Ｂ。這些菌落還需通過ＰＣＲ擴(kuò)增進(jìn)一步鑒定。ＡＢ圖３．３Ｆｉｇ．３Ｇ４１８篩選高拷貝陽性轉(zhuǎn)化子Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｈｉｇｈ—ｃｏｐｙｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｂｙＧ４１８Ａ：轉(zhuǎn)化子在不含Ｇ４１８的ＹＰＤ培養(yǎng)基生長情況Ｂ：轉(zhuǎn)化子在含５ｍｇ／ｍｌＧ４１８的ＹＰＤ培養(yǎng)基的生長情況（３）陽性轉(zhuǎn)化子的ＰＣＲ鑒定提取在含５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ平板上長出的菌落及ｐＰＩＣ９Ｋ質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的陰性轉(zhuǎn)化子提取基因組，并進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖３．４所示。從Ａ圖中可以看出，除１０號沒有擴(kuò)增出條帶外，其他的都擴(kuò)出了兩條條帶，一條約２．２ｋｂ的片段（菌株上的野生型ＡＯＸｌ基因），另一條約１７００ｂｐ的片段（目的基因ＰｒｏＫ（１２００ｂｐ）和載體上ＡＯＸｌ（４９２ｂｐ）之和）?？蛰d體轉(zhuǎn)化子也擴(kuò)增出了兩條帶，一條約２．２ｋｂ的片段為菌株上的野生型ＡＯＸｌ基因，另一條約５００ｂｐ的片段是未插入任何序列的空載體上ＡＯＸｌ（４９２ｂｐ）基因片段。若ＰＣＲ產(chǎn)物有２條帶，一條為ＡＯＸｌ基因的２．２ｋｂ條帶，另一條為目的條帶，說旺ＪｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ質(zhì)粒已經(jīng)整合到畢赤酵母基因組中，并且是Ｍｕｔ＋（甲醇利用型），可以以甲醇為唯一碳源進(jìn)行誘導(dǎo)。大連理：［大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文圖３．４Ｆｉｇ．３．４轉(zhuǎn)化子的ＰＣＲ擴(kuò)增分析ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｌｒｏｌＡ：Ｍ：ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ１－１７：ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ轉(zhuǎn)化子ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果Ｂ：Ｍ：ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ１～６：ｐＰＩＣ９Ｋ轉(zhuǎn)化子ＰＣＲ擴(kuò)增結(jié)果３．４．２蛋白酶Ｋ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳鑒定及活性測定將經(jīng)過ＰＣＲ鑒定正確的轉(zhuǎn)化子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，由于ｐＰＩＣ９Ｋ是一種分泌表達(dá)載體，所以只需對發(fā)酵液進(jìn)行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳分析即可。誘導(dǎo)表達(dá)１４４ｈ后收集發(fā)酵液，離心去菌體后，?。矗担皟荷锨褰?jīng)１００％ＴＣＡ濃縮后進(jìn)行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳鑒定。結(jié)果如圖５，從圖中可以看出ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ載體轉(zhuǎn)化的酵母在２９ＫＤａ左右有一條條帶，與成品蛋白酶Ｋ大小相似，而ｐＰＩＣ９Ｋ空載轉(zhuǎn)化的酵母沒有類似的條帶。用偶氮酪蛋白法測定的發(fā)酵液也有活性，說明蛋白酶Ｋ在酵母體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。卜１孫㈨１）一＿簟圖３．５蛋白酶Ｋ的誘導(dǎo)表達(dá)Ｆｉｇ．３．５ＴｈｅＳＤＳ·ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｙｅａｓｔＭ：ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１：對照組發(fā)酵液上清２：陽性轉(zhuǎn)化子發(fā)酵液上清３：成品蛋白酶Ｋ（購自大連寶生物公司）蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化３．４．３蛋白酶Ｋ樣品的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析為確定表達(dá)的蛋白為蛋白酶Ｋ，利用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ進(jìn)行分析。結(jié)果如下圖所示。圖３．６蛋白酶Ｋ的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析Ｆｉｇ．３．６ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ在蛋白酶Ｋ的Ｃ端加上了六個(gè)組氨酸標(biāo)簽，所以利用抗Ｈｉｓ．Ｔａｇ抗體進(jìn)行雜交，結(jié)果顯示，片段具有很好的特異性，且大小正確，說明目的蛋白即為蛋白酶Ｋ。３．４．４誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白酶Ｋ表達(dá)量的影響隨著菌體的生長，目的產(chǎn)物的表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)菌體生長到一定程度后，產(chǎn)物分泌減少，而菌體的代謝產(chǎn)物增加，并且菌體裂解會釋放一些蛋白酶，對產(chǎn)物的活性及穩(wěn)定性具有一定的影響。因此誘導(dǎo)時(shí)間也是影響產(chǎn)物表達(dá)量及穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)在２８℃，甲醇濃度為０．５％的條件下誘導(dǎo)表達(dá)１６８ｈ，每２４ｈ取一次樣，通過測定酶活濃度比較蛋白酶Ｋ的表達(dá)量。如圖３．７所示，通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，不同誘導(dǎo)時(shí)間下，蛋白酶Ｋ的表達(dá)量差異顯著。在１２０ｈ之前，酶活濃度逐漸升高，說明產(chǎn)物量逐漸增加，在１２０ｈ時(shí)蛋白酶Ｋ酶活濃度最高，表達(dá)量最高，之后表達(dá)量略有降低，但不明顯，可能與蛋白酶Ｋ本身性質(zhì)穩(wěn)定有關(guān)。因此在１２０ｈ左右收獲產(chǎn)物可以得到較高的表達(dá)量。大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文６５３２山０拍船７＂２∞１２０’４４’∞ｌｎｄｕ穗Ｉ∞ｌｉｍｅ（ｈ）圖３．７誘導(dǎo)時(shí)間對表達(dá)量的影響Ｆｉｇ．３．７ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３．４．５誘導(dǎo)劑濃度對蛋白酶Ｋ表達(dá)量的影響畢赤酵母是一種甲醇利用型酵母，可以以甲醇為唯一碳源，并且ｐＰＩＣ９Ｋ—ＰｒｏＫ轉(zhuǎn)化子是Ｍｕｔ＋型，需要甲醇作為誘導(dǎo)劑。甲醇濃度過低會影響菌體生長及產(chǎn)物的表達(dá)，但濃度過高會對菌體細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，也會影響產(chǎn)物的表達(dá)。所以要對甲醇濃度進(jìn)行優(yōu)化。通過測定在不同誘導(dǎo)劑濃度下表達(dá)的蛋白酶Ｋ的活性濃度來比較蛋白酶Ｋ的表達(dá)量。圖３．８為測定誘導(dǎo)第１２０ｈ的發(fā)酵液的酶活性濃度，從圖中可以看出，不同誘導(dǎo)劑濃度下蛋白酶Ｋ的表達(dá)量沒有顯著差異，在０．７５％時(shí)蛋白酶Ｋ表達(dá)量略有升高，所以實(shí)驗(yàn)選用０．７５％的甲醇濃度作為以后的誘導(dǎo)濃度。蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化圖３．８誘導(dǎo)劑濃度對表達(dá)量的影響Ｆｉｇ．３．８ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｄｕｃｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０１１ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３．４．６誘導(dǎo)ｐＨ對蛋白酶Ｋ表達(dá)的影響酵母在ｐＨ２．８－８．０條件下均可以生長，不同ｐＨ條件下茵體的生長狀態(tài)及活性仍存在差異，并且ｐＨ對目標(biāo)產(chǎn)物的穩(wěn)定性也有一定的影響。實(shí)驗(yàn)利用不同ｐＨ的磷酸緩沖液作為培養(yǎng)基的緩沖體系配ｆｌ；ＵｐＨ為３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基，在甲醇濃度為０．７５％的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過測定發(fā)酵液中蛋白酶Ｋ的活性濃度比較產(chǎn)物的表達(dá)量，結(jié)果如圖３．９所示。從圖中可以看出，不同ｐＨ條件下，蛋白酶Ｋ的表達(dá)量差異顯著，在ｐＨｉ７．０時(shí)酶活性濃度最高，表明此ｐＨ條件下蛋白酶Ｋ的表達(dá)量最高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在ｐＨ為３．０或４．０時(shí)菌體生長緩慢，在ｐＨｉ５．０－８．０時(shí)菌體能夠正常生長，但ｐＨ為７．０時(shí)活性最高，可能由于ｐＨ也會影響蛋白酶Ｋ的活性。通過數(shù)據(jù)分析，選用ｐＨ７．０為誘導(dǎo)條件。大連理工大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文６５‘３２ｍ∈＾ｚｕ山１２３‘６ｅ７８９ｐＨｏｆ盯埒曲ｕｍ圖３．９ｐＨ對蛋白酶Ｋ表達(dá)量的影響Ｆｉｇ．３．９ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３．４．７誘導(dǎo)溫度對蛋白酶Ｋ表達(dá)量的影響溫度是影響產(chǎn)物表達(dá)量的一個(gè)重要因素，對外源蛋白的活性及穩(wěn)定性也有很大影響。畢赤酵母最適生長溫度為２８—３０℃，研究報(bào)道，在１５－３０℃之間均可以進(jìn)行外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)。溫度升高，會提高外源蛋白的表達(dá)，但是較高的表達(dá)效率會導(dǎo)致蛋白折疊錯(cuò)誤，還會使菌體死亡。降低溫度可以誡緩菌體的生長代謝及產(chǎn)物的表達(dá)，提高外源蛋白折疊的正確率，但是會降低產(chǎn)物的表達(dá)量。因此選擇合適的誘導(dǎo)溫度對提高外源蛋白的表達(dá)量是至關(guān)重要的。實(shí)驗(yàn)測定了在２０℃、２５℃和３０℃下誘導(dǎo)的蛋白酶Ｋ的活性（如圖３．１０），通過比較活性的高低確定蛋白酶Ｋ表達(dá)量的大小。從圖中可以看出，不同溫度下，蛋白酶Ｋ的表達(dá)量差異顯著，在２５℃下蛋白酶Ｋ的表達(dá)量最高；在２０℃下，菌體生長緩慢，蛋白酶Ｋ表達(dá)量較低；２８℃下，菌體生長較快，但測得的酶活性稍低于２５℃誘導(dǎo)下的酶活性，可能與蛋白酶Ｋ的穩(wěn)定性有關(guān)。蛋白酶Ｋ的密碼子優(yōu)化及其在酵母中的表達(dá)與分離純化７６５４３２，Ｏ１５加筠Ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）圖３．１０溫度對蛋白酶Ｋ表達(dá)量的影響Ｆｉｇ．３．１０ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３．４．８發(fā)酵罐發(fā)酵表達(dá)蛋白酶Ｋ利用前面搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的表達(dá)條件進(jìn)行５Ｌ發(fā)酵罐發(fā)酵，菌種接入發(fā)酵罐后每小時(shí)取一次樣，測定樣品的茵體濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖３．１１所示。從圖中可以看出，菌體生長２０ｈ后，生長進(jìn)入穩(wěn)定期，此時(shí)開始誘導(dǎo)蛋白酶Ｋ的表達(dá)。在菌體生長階段，溫度設(shè)為２８℃，ｐＨｉ７．０，通氣為０．９ｖ／（ｖ·ｒａｉｎ），轉(zhuǎn)數(shù)為３３０ｒ。上罐１６ｈ左右，溶氧ＤＯ突然上升，說明發(fā)酵罐內(nèi)原有的甘油已消耗盡，補(bǔ)加甘油使菌體繼續(xù)生長至菌體濃度不再增加。此時(shí)菌體密度０１）６００吸光值為２０左右，停止補(bǔ)加甘油，饑餓２０ｍｉｎ后，開始補(bǔ)加甲醇誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時(shí)，溫度設(shè)為２５℃。甲醇的補(bǔ)加和ＤＯ偶聯(lián)，當(dāng)溶氧高于３５％時(shí)，補(bǔ)加甲醇，并利用氣象色譜檢測甲醇濃度，使其濃度處于０．７５％一１．Ｏ％之間。利用優(yōu)化的條件，蛋白酶Ｋ的表達(dá)量可以達(dá)到２．２ｇ／Ｌ。在相同的條件下，發(fā)酵罐誘導(dǎo)蛋白酶Ｋ的表達(dá)量是搖瓶誘導(dǎo)蛋白酶Ｋ表達(dá)量的６—７倍左右，這可能由于發(fā)酵罐發(fā)酵比搖瓶發(fā)酵的通氧量更充足?！と苎趿渴怯绊懜呙芏劝l(fā)酵的關(guān)鍵因素。溶氧量主要取決于通氣量、攪拌功率及罐壓等因素，因此可以通過提高通氣大連理．Ｔ．大學(xué)專業(yè)學(xué)位碩士學(xué)位論文量，增加攪拌功率等方法增加溶氧。但是溶氧過高會導(dǎo)致茵體氧中毒，從而抑制菌體的生長繁殖。圖３．１１畢赤酵母生長曲線Ｆｉｇ．３．１１ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆｙｅａｓｔ３．５小結(jié)利用電轉(zhuǎn)化法將上一章構(gòu)建的ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ質(zhì)粒導(dǎo)入酵母體內(nèi)，并利用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基及ＰＣＲ鑒定篩選陽性轉(zhuǎn)化子，利用含Ｇ４１８的ＹＰＤ培養(yǎng)基篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，最后篩選出１７個(gè)能夠在含有５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的培養(yǎng)基上生長的陽性轉(zhuǎn)化子。誘導(dǎo)表達(dá)后通過ＳＤＳ．ＰＡＧＥ電泳分析及酶活測定，確定了蛋白酶Ｋ在畢赤酵母中能夠分泌表達(dá)。通過對蛋白酶Ｋ誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了蛋白酶Ｋ的高效表達(dá)，在５Ｌ發(fā)酵罐中蛋白酶Ｋ的表達(dá)量可以達(dá)到２．２∥Ｌ發(fā)酵液。