畢赤酵母表達(dá)操作手冊(cè)(精譯版)

2023年12月4日發(fā)(作者：滳滳打車(chē))

畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體試劑盒

畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體試劑盒

用于在含多拷貝基因的畢赤酵母菌中表達(dá)并分離重組蛋白

綜述：

基本特征：

作為真核生物，畢赤酵母具有高等真核表達(dá)系統(tǒng)的許多優(yōu)點(diǎn)：如蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等。不僅如此，操作時(shí)與及釀酒酵母同樣簡(jiǎn)單。它比桿狀病毒或哺乳動(dòng)物組織培養(yǎng)等其它真核表達(dá)系統(tǒng)更快捷、簡(jiǎn)單、廉價(jià)，且表達(dá)水平更高。同為酵母，畢赤酵母具有與釀酒酵母相似的分子及遺傳操作優(yōu)點(diǎn)，且它的外源蛋白表達(dá)水平是后者的十倍以至百倍。這些使得畢赤酵母成為非常有用的蛋白表達(dá)系統(tǒng)。

與釀酒酵母相似技術(shù)：

許多技術(shù)可以通用：

互補(bǔ)轉(zhuǎn)化 基因置換 基因破壞 另外，在釀酒酵母中應(yīng)用的術(shù)語(yǔ)也可用于畢赤酵母。例如：HIS4基因都編碼組氨酸脫氫酶；兩者中基因產(chǎn)物有交叉互補(bǔ)；釀酒酵母中的一些野生型基因與畢赤酵母中的突變基因相互補(bǔ)，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在畢赤酵母中都有各自相互補(bǔ)的突變基因。

畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母：

畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母，可利用甲醇作為其唯一碳源。甲醇代謝的第一步是：醇氧化酶利用氧分子將甲醇氧化為甲醛，還有過(guò)氧化氫。為避免過(guò)氧化氫的毒性，甲醛代謝主要在一個(gè)特殊的細(xì)胞器－過(guò)氧化物酶體－里進(jìn)行，使得有毒的副產(chǎn)物遠(yuǎn)離細(xì)胞其余組分。由于醇氧化酶與O2的結(jié)合率較低，因而畢赤酵母代償性地產(chǎn)生大量的酶。而調(diào)控產(chǎn)生醇過(guò)氧化物酶的啟動(dòng)子也正是驅(qū)動(dòng)外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的啟動(dòng)子。

兩種醇氧化酶蛋白：

畢赤酵母中有兩個(gè)基因編碼醇氧化酶－AOX1及AOX2。細(xì)胞中大多數(shù)的醇氧化酶是AOX1基因產(chǎn)物。甲醇可緊密調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)AOX1基因的高水平表達(dá)，較典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分離，含AOX1啟動(dòng)子的質(zhì)粒可用來(lái)促進(jìn)編碼外源蛋白的目的基因的表達(dá)。AOX2基因與AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中帶AOX2基因的菌株比帶AOX1基因菌株慢得多，通過(guò)這種甲醇利用緩慢表型可分離Muts菌株。

表達(dá)：

AOX1基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄水平受調(diào)控。在甲醇中生長(zhǎng)的細(xì)胞大約有5%的polyA+

RNA來(lái)自AOX1基因。AOX1基因調(diào)控分兩步：抑制/去抑制機(jī)制加誘導(dǎo)機(jī)制。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在含葡萄糖的培養(yǎng)基中，即使加入誘導(dǎo)物甲醇轉(zhuǎn)錄仍受抑制。為此，用甲醇進(jìn)行優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)，推薦在甘油培養(yǎng)基中培養(yǎng)。注意即使在甘油中生長(zhǎng)（去抑制）時(shí)，仍不足以使AOX1基因達(dá)到最低水平的表達(dá)，誘導(dǎo)物甲醇是AOX1基因可辨表達(dá)水平所必需的。

AOX1突變表型：

缺失AOX1基因，會(huì)喪失大部分的醇氧化酶活性，產(chǎn)生一種表型為Muts的突變株（methanol utilization slow），過(guò)去稱(chēng)為Mut，而Muts可更精確地描述突變子的表型。結(jié)果細(xì)胞代謝甲醇的能力下降，因而在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇為唯一碳源的野生型菌株。這兩種表型用來(lái)檢測(cè)外源基因在畢赤酵母轉(zhuǎn)化子中的整合方式。

蛋白胞內(nèi)及分泌表達(dá)：

外源蛋白可在畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)或分泌至胞外。分泌表達(dá)需要蛋白上的信號(hào)肽序列，將外源蛋白靶向分泌通路。幾種不同的分泌信號(hào)序列已被成功應(yīng)用，包括幾種外源蛋白本身分制作者：陳苗 商漢橋

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泌信號(hào)序列，利用釀酒酵母α因子前原肽信號(hào)序列也獲得許多成功。

分泌表達(dá)外源蛋白的最大優(yōu)點(diǎn)是：畢赤酵母只分泌很少的自身蛋白，加上畢赤酵母最小生長(zhǎng)培養(yǎng)基中只有少量的蛋白，這意味著分泌的外源蛋白是培養(yǎng)基中蛋白的主要組成成份，也可算作蛋白純化的第一步。注意，如果外源蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中有可識(shí)別的糖基化位點(diǎn)（Asn-X-Ser/Thr）,則這些位點(diǎn)可能發(fā)生糖基化。

翻譯后修飾：

與釀酒酵母相比，畢赤酵母在分泌蛋白的糖基化方面有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)椴粫?huì)使其過(guò)糖基化。釀酒酵母與畢赤酵母大多數(shù)為N-連接糖基化高甘露糖型，然而畢赤酵母中蛋白轉(zhuǎn)錄后所增加的寡糖鏈長(zhǎng)度（平均每個(gè)支鏈8-14個(gè)甘露糖殘基）比釀酒酵母中的（50-150個(gè)甘露糖殘基）短得多。

另外，釀酒酵母核心寡糖有末端α-1,3聚糖連接頭，而畢赤酵母則沒(méi)有。一般認(rèn)為釀酒酵母中糖基化蛋白的α-1,3聚糖接頭與蛋白的超抗原性有關(guān)，使得這些蛋白不適于治療應(yīng)用。雖然未經(jīng)證明，但這對(duì)畢赤酵母產(chǎn)生的糖蛋白不構(gòu)成問(wèn)題，因?yàn)楫叧嘟湍副磉_(dá)蛋白與高級(jí)真核生物糖蛋白結(jié)構(gòu)相似。

選擇載體用于基因多拷貝整合：

在某些情況下，畢赤酵母中重組基因多拷貝整合可增加所需蛋白的表達(dá)量。該試劑盒中的三個(gè)載體均可用于在體內(nèi)（pPIC3.5K, pPIC9K）或體外（pAO815）產(chǎn)生并分離多拷貝插入，同時(shí)可檢測(cè)增加重組基因的拷貝數(shù)是否增加蛋白表達(dá)量。體內(nèi)整合可通過(guò)高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入；而體外整合可通過(guò)連接產(chǎn)生外源基因的串聯(lián)插入。pPIC3.5K,

pAO815用于胞內(nèi)表達(dá)，而pPIC9K用于分泌表達(dá)，所有載體均利用AOX1啟動(dòng)子來(lái)誘導(dǎo)高水平表達(dá)。

多拷貝插入頻率：

畢赤酵母His+轉(zhuǎn)化子高拷貝整合事件自發(fā)發(fā)生的概率為1－10%，體內(nèi)方法可篩選可能插入多拷貝外源基因的His+轉(zhuǎn)化子，體外方法可通過(guò)連接構(gòu)建多拷貝子。當(dāng)選擇His+轉(zhuǎn)化子時(shí)，它們中插入體外構(gòu)建結(jié)構(gòu)多聚體的概率很高。

體內(nèi)多拷貝插入的產(chǎn)生：

Ppic3.5k及Ppic9k含有細(xì)菌kan基因，賦予畢赤酵母遺傳霉素抗性，注意Kan并不賦予畢赤酵母卡那霉素抗性。遺傳霉素抗性水平主要依賴(lài)整合的kan基因的數(shù)目。單拷貝Ppic3.5k或Ppic9k整合入畢赤酵母基因組后，賦予畢赤酵母約0.25mg/ml的遺傳霉素抗性水平。任何載體多拷貝整合可增加遺傳霉素抗性水平，從0.5mg/ml（1-2拷貝）到4mg/ml（7-12拷貝）。由于kan基因與表達(dá)盒（pAOX1及目的基因）之間有遺傳連鎖，可從遺傳霉素高抗性推斷該克隆所包含多拷貝目的基因數(shù)。由于基因的劑量效益，蛋白的表達(dá)可能會(huì)增加。因此，kan基因可檢測(cè)轉(zhuǎn)化子是否含有多拷貝目的基因。下圖顯示多拷貝插入及kan基因與表達(dá)盒的連鎖。

制作者：陳苗 商漢橋

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遺傳霉素直接選擇：

在酵母中對(duì)遺傳霉素抗性進(jìn)行直接選擇并不十分有效，因?yàn)樾罗D(zhuǎn)化的細(xì)胞需要時(shí)間表達(dá)足夠量的抗性因子。由于酵母生長(zhǎng)比細(xì)菌慢得多，大部分重組酵母在積累足夠多的抗性因子

以抵抗平板上抗生素之前就已經(jīng)被殺死了。最有效的篩選遺傳霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先對(duì)HIS＋轉(zhuǎn)化子進(jìn)行選擇，再進(jìn)行不同水平遺傳霉素抗性篩選。

雖然可以用電泳進(jìn)行直接篩選，但用在遺傳霉素篩選之后再進(jìn)行電泳篩選，獲得含高拷貝克隆的機(jī)會(huì)更大，大約可獲得5-9拷貝的克隆，而直接電泳選擇只能獲得平均為1-3拷貝的克隆。原生質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)不能用遺傳霉素直接選擇。

體外多拷貝插入的產(chǎn)生：

下圖顯示如何產(chǎn)生多表達(dá)盒插入載體以轉(zhuǎn)化畢赤酵母。目的基因插入獨(dú)個(gè)EcoRI位點(diǎn)

后，產(chǎn)生的表達(dá)盒（pAOX1及目的基因）上下游側(cè)翼分別為獨(dú)個(gè)的BglII及BamHI位點(diǎn)。

含目的基因的pAOX815用BglII及BamHI消化以分離表達(dá)盒，表達(dá)盒再插入BamHI位點(diǎn)以產(chǎn)生串聯(lián)重復(fù)表達(dá)盒，重復(fù)該插入程序可產(chǎn)生一系列含單個(gè)HIS4基因及逐漸增加數(shù)目表達(dá)盒的載體。

用體外形成的多拷貝子轉(zhuǎn)化畢赤酵母增加了多拷貝表達(dá)盒重組子出現(xiàn)的頻率，可設(shè)計(jì)包含一特定數(shù)目多拷貝插入的畢赤酵母重組子。

轉(zhuǎn)化及整合：

可產(chǎn)生兩個(gè)不同表型的His+重組菌株：質(zhì)粒DNA線性化位置不同，轉(zhuǎn)化GS115后可產(chǎn)生兩種轉(zhuǎn)化子His+Mut+及His+Muts。KM71只產(chǎn)生His+Muts，因?yàn)樵摼隇镸uts表型。兩種重組子Mut＋及 Muts都是有用的，因?yàn)橐粋€(gè)表型可能比另一個(gè)表型更有利于蛋白表達(dá)。理想條件下，每一個(gè)表型應(yīng)該檢測(cè)6-10個(gè)重組子。沒(méi)有辦法預(yù)測(cè)哪個(gè)結(jié)構(gòu)或克隆更利于蛋白表達(dá)。強(qiáng)烈推薦用PCR分析重組子來(lái)證實(shí)整合情況。

成功將基因構(gòu)建至AOX1啟動(dòng)子下游后，線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母時(shí)激發(fā)重組。下圖顯示用不同酶消化時(shí)產(chǎn)生何種重組子。

限制酶

SalI或StuI

SacI

BglII

插入事件

插入his4

插入5’AOX1

取代AOX1

GS115表型

His+Mut+

His+Mut+

His+Muts

KM71表型

His+Muts

His+Muts

His+Muts（不推薦）

制作者：陳苗 商漢橋

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表達(dá)及擴(kuò)大培養(yǎng)：

用PCR證實(shí)畢赤酵母重組后，可檢測(cè)His+Mut+及 His+Muts的表達(dá)。小規(guī)模培養(yǎng)每個(gè)重組子，用甲醇誘導(dǎo)，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn).如果是胞內(nèi)表達(dá)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞沉淀用SDS-PAGE分析;如果是分泌表達(dá)，分析每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞及上清。如果有蛋白的抗體，推薦既用考馬斯亮藍(lán)染色又用western blot分析SDS-PAGE凝膠。如果可以,建議檢測(cè)蛋白活性。因?yàn)椴⒉皇撬械鞍锥寄苓_(dá)到g/l的水平，所以建議進(jìn)行western blot或活性分析，不要僅做SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色分析。

如何選擇最佳的表達(dá)蛋白畢赤酵母菌株及優(yōu)化誘導(dǎo)見(jiàn)P49-50。如表達(dá)已達(dá)最優(yōu)，大規(guī)模表達(dá)以產(chǎn)生更多蛋白。

制作者：陳苗 商漢橋

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方法

畢赤菌株表型：

畢赤酵母菌GS115及KM71在組氨酸脫氫酶位點(diǎn)（His4）有突變,因而不能合成組氨酸，所有表達(dá)質(zhì)粒都有HIS4基因可與宿主進(jìn)行互補(bǔ)，通過(guò)不含組氨酸的培養(yǎng)基來(lái)選擇轉(zhuǎn)化子。

GS115及KM71自發(fā)回復(fù)突變到His＋原養(yǎng)生物機(jī)率小于1/108。

KM71的親本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因（arg4）有突變，在不含精氨酸的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)。用野生型ARG4基因破壞AOX1基因后，產(chǎn)生KM71 MutsArg+His-菌株。

GS115及KM71都可在復(fù)合培養(yǎng)基如YPD（YEPD）及含組氨酸的最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)化之前，GS115及KM71都不能在最小培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，因?yàn)樗鼈兪荋is-。

KM71結(jié)構(gòu)：

ARG4基因（約2kb）插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密碼子)及SalI(AOX1基因227/228密碼子)位點(diǎn)。ARG4取代了AOX1基因16－227密碼子。此結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化至KM71親本菌（arg4his4）中,分離Arg+轉(zhuǎn)化子并分析Muts表型。Arg+轉(zhuǎn)化子遺傳分析顯示野生型AOX1被aox1::ARG4結(jié)構(gòu)所取代。

重點(diǎn)：

用KM71的優(yōu)點(diǎn)是，不需要在甲醇最小培養(yǎng)基中篩選Mut表型。所有轉(zhuǎn)化子都是Muts表型。第二，AOX1位點(diǎn)沒(méi)有被完全缺失，理論上可用你的目的結(jié)構(gòu)通過(guò)基因取代方法替換aox1::ARG4結(jié)構(gòu)，這樣重組菌株的表型是His+MutsArg-，這意味著重組菌株生長(zhǎng)時(shí)需精氨酸。不幸的是，僅添加精氨酸并不能完全緩和arg4突變的影響，arg4菌株在含精氨酸的最小培養(yǎng)基中不能很好地生長(zhǎng)。因此不推薦在KM71中通過(guò)取代aox1::ARG4結(jié)構(gòu)來(lái)獲得His＋轉(zhuǎn)化子。

菌株表達(dá)對(duì)照：

GS115/His+Muts 白蛋白：該菌株為篩選畢赤酵母分泌表達(dá)轉(zhuǎn)化子與Muts表型時(shí)的對(duì)照。血清白蛋白基因及其自身分泌信號(hào)被整合進(jìn)畢赤酵母AOX1位點(diǎn)。該菌株可分泌白蛋白（67kDa）到培養(yǎng)基中，分泌水平＞1g/l。

GS115/His+Mut+ β－半乳糖苷酶：該菌株為篩選畢赤酵母轉(zhuǎn)化子胞內(nèi)表達(dá)與Mut+表型時(shí)的對(duì)照。β－半乳糖苷酶（lacZ）基因被整合進(jìn)畢赤酵母his4位點(diǎn)，該菌株表達(dá)β－半乳糖苷酶（117 kDa），達(dá)到通過(guò)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色或ONPG分析可測(cè)水平。

畢赤酵母菌株生長(zhǎng)：

畢赤酵母生長(zhǎng)溫度為28-30度（液體、平板、斜面）。在32度以上誘導(dǎo)生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)蛋白表達(dá)有害，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞死亡。

另外注意點(diǎn)有：

1在YPD中，處于對(duì)數(shù)期的Mut+、Muts畢赤酵母倍增時(shí)間為2小時(shí)

2除了在甲醇中生長(zhǎng)速度不同外，Mut+、Muts生長(zhǎng)速度沒(méi)有差別

3甲醇培養(yǎng)基（MM）中，處于對(duì)數(shù)期的Mut+倍增時(shí)間為4-6小時(shí)

4甲醇培養(yǎng)基（MM）中，處于對(duì)數(shù)期的Muts倍增時(shí)間為18小時(shí)

51OD600=5×107細(xì)胞/ml

注意：生長(zhǎng)特性依重組菌株不同而不同

制作者：陳苗 商漢橋

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在甲醇中生長(zhǎng)：

當(dāng)使用甲醇平板或培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，建議每天添加甲醇以補(bǔ)償甲醇揮發(fā)及消耗。

1平板培養(yǎng)時(shí)，在倒置平板蓋中加入100ul 100%甲醇

2液體培養(yǎng)時(shí)，加入100%甲醇至終濃度為0.5%

3部分研究者在進(jìn)行液體培養(yǎng)時(shí)，對(duì)Muts菌株每天加甲醇至濃度為1%，對(duì)Mut+菌株每天加甲醇至濃度為3%時(shí)，對(duì)液體培養(yǎng)沒(méi)有不良影響。

貯存：貯存細(xì)胞幾周或幾月，用YPD培養(yǎng)基或YPD瓊脂斜面

1挑取所需菌株單克隆在YPD平板上劃線生長(zhǎng)

2挑取單克隆轉(zhuǎn)移至YPD進(jìn)行穿刺培養(yǎng)，30度2天

3細(xì)胞在4度可放幾周

幾月或幾年，存于－80度

1挑取所需菌株單克隆在YPD中過(guò)夜培養(yǎng)

2收集細(xì)胞，在含15%甘油的YPD中懸浮至終OD600為50-100（大約2.5-5.0×109細(xì)胞/ml）

3細(xì)胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰凍再貯存于-80度。

注意：在4度或－80度長(zhǎng)期保存后，用之前建議在MM、MD或MGY平板上劃線培養(yǎng)以檢測(cè)His+轉(zhuǎn)化子的表型是否正確及其活力。

大腸桿菌菌株：

大腸桿菌菌株表型：提供 Top10F’以防沒(méi)有合適的菌株。其它合適的菌株為DH5αF’，JM109或其它重組缺失菌株（recA），最好是endA，及帶有選擇性的F’附加體。Top10F’適用于重組及單鏈拯救。

如果不需進(jìn)行單鏈DNA拯救，也可用不含F(xiàn)’附加體的大腸桿菌菌株。

建議：建議凍存Top10F’

1在5ml含50－100mg/ml四環(huán)素的LB中培養(yǎng)Top10F’過(guò)夜

2取0.85ml培養(yǎng)液加0.15ml滅菌甘油完全混勻

3轉(zhuǎn)入凍存瓶中，凍在液氮或干冰/酒精浴中

4存于－80度

選擇畢赤酵母表達(dá)載體：

選擇載體：如果目的蛋白是細(xì)胞溶質(zhì)型且是無(wú)糖基化蛋白，可選擇胞內(nèi)表達(dá)蛋白。如果目的蛋白是正常分泌、糖基化蛋白或直接分泌至胞內(nèi)細(xì)胞器內(nèi)，可嘗試分泌表達(dá)目的蛋白。

建議用體內(nèi)及體外方法產(chǎn)生并分離外源基因多拷貝插入子。無(wú)法預(yù)測(cè)哪種方法適用于你的蛋白，每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)如下：

體外方法 pAO815

優(yōu)點(diǎn)

可構(gòu)建特定數(shù)目的多拷貝子

大多數(shù)His＋轉(zhuǎn)化子含有正確的特定數(shù)目插入

篩選多插入子很容易，因?yàn)榇蟛糠諬is＋轉(zhuǎn)化子含有多拷貝目的基因

體外構(gòu)建可以分析拷貝數(shù)對(duì)蛋白表達(dá)的影響

多拷貝插入位于單一位點(diǎn)

載體上無(wú)需另外的藥物抗性標(biāo)記

缺點(diǎn)

克隆特定數(shù)目多拷貝子需要更多工作

載體可能會(huì)很大，與基因大小及插入拷貝數(shù)有關(guān)

在中可能會(huì)發(fā)生重排

制作者：陳苗 商漢橋

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體外方法 Ppic3.5k或Ppic9k

優(yōu)點(diǎn)

開(kāi)始實(shí)驗(yàn)比較容易，轉(zhuǎn)化畢赤酵母前載體中只需克隆單拷貝基因

1-10%的His＋轉(zhuǎn)化子有自發(fā)的多拷貝插入

載體平均大小與其它畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)相似

多拷貝插入位于單一位點(diǎn)

缺點(diǎn)

定量篩選－遺傳霉素抗性并不一定與基因拷貝數(shù)相關(guān)

篩選His＋轉(zhuǎn)化子需要做很多工作，因?yàn)橐獜某汕先f(wàn)個(gè)His＋轉(zhuǎn)化子中才能篩選到足夠多的遺傳霉素抗性克隆進(jìn)行檢測(cè)

多拷貝插入的數(shù)目不知（盡管可用southern 或dot blot分析方法進(jìn)行檢測(cè)）

遺傳霉素篩選對(duì)細(xì)胞密度敏感，可能會(huì)分離到假陽(yáng)性

特點(diǎn)：下表顯示畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體的一般特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)：

特點(diǎn)

5‘AOX1

段

α-factor

信號(hào)序列

MCS

TT

HIS4

編碼α因子信號(hào)序列的269bp，用于畢赤酵母分泌表達(dá)（只能用于Ppic9k）

多克隆位點(diǎn)

描述

含AOX1啟動(dòng)子的約1000bp片優(yōu)點(diǎn)

畢赤酵母中可實(shí)現(xiàn)甲醇誘導(dǎo)的高水平表達(dá)

分泌所需蛋白至培養(yǎng)基中

在表達(dá)載體中插入目的基因

AOX1基因自帶的轉(zhuǎn)錄終止及mRNA有效的轉(zhuǎn)錄終止及多聚腺polyA信號(hào)（約260bp） 苷酸化

畢赤酵母野生型基因編碼組氨為選擇畢赤酵母重組菌株提供選酸脫氫酶（約2.4kb），用于與畢赤酵擇標(biāo)記

母his4菌株進(jìn)行互補(bǔ)

AOX1基因序列，在TT3‘遠(yuǎn)端序列（約650bp）

Amp抗性基因

復(fù)制起始

質(zhì)粒靶向整合進(jìn)AOX1基因

用于選擇、復(fù)制及維護(hù)

3‘AOX1

Amp

pBR322復(fù)制起點(diǎn)

BamHI

BglII

NotI

SacI

SalI

StuI

Kan

單一酶切位點(diǎn) 可線性化載體，使有效插入畢赤（StuI在Ppic3.5k或Ppic9k中不酵母基因組產(chǎn)生Mut+或Muts重組子

是唯一的）

來(lái)自Tn903的卡那抗性基因，賦通過(guò)增加的抗遺傳霉素抗性，可予卡那基因抗性，賦予畢赤酵在體內(nèi)篩選多拷貝插入子

母遺傳霉素抗性（Ppic3.5k或Ppic9k） 在大腸桿菌中篩選Kan抗性菌株

在該試劑盒中，任何畢赤酵母表達(dá)載體都沒(méi)有酵母復(fù)制起始位點(diǎn)。只有當(dāng)質(zhì)粒與畢赤酵母基因組發(fā)生重組時(shí)，才能分離到HIS＋轉(zhuǎn)化子。

Ppic9k：含卡那基因，體內(nèi)篩選多拷貝子插入，分泌重組蛋白至培養(yǎng)基中。在GS115及KM71中有功能。

制作者：陳苗 商漢橋

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1 9276bp融合載體

2 在α-factor分泌信號(hào)閱讀框中含有用于克隆的4個(gè)單限制酶位點(diǎn)。SnaBI、EcoRI、AvrII、NotI

3 α-factor分泌信號(hào)分泌表達(dá)目的蛋白。表達(dá)時(shí)，目的基因必須克隆進(jìn)信號(hào)序列起始密碼的讀碼框中

畢赤酵母HIS4篩選

GS115或KM71，在AOX1基因處插入，用SacI線性化（對(duì)于GS115產(chǎn)生His+Mut+，對(duì)于KM71產(chǎn)生His+Muts）

在HIS4位點(diǎn)插入，用SalI線性化（對(duì)于GS115產(chǎn)生His+Mut+，對(duì)于KM71產(chǎn)生His+Muts）

在GS115菌株中，替換AOX1基因，用BglII線性化（產(chǎn)生His+Muts）

克隆進(jìn)畢赤酵母多拷貝表達(dá)載體：

介紹：下面列出用這些載體進(jìn)行克隆策略時(shí)應(yīng)考慮的方針。考慮位點(diǎn)，如用Ppic9k載體，應(yīng)考慮將目的基因克隆進(jìn)α-factor信號(hào)序列讀碼框中。

建議將3個(gè)超螺旋畢赤酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，以便長(zhǎng)期保存。

1用滅菌水或TE緩沖液稀釋1ul質(zhì)粒（1ug/ul）至10-100pg/ul

2取1-2ul稀釋質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)，在含50-100 ug/mlAmp的LB平板上選擇

一般考慮：下面是應(yīng)用pAO815、 Ppic3.5k或Ppic9k時(shí)的一般考慮

1畢赤酵母的密碼偏愛(ài)與釀酒酵母相同，已證明許多釀酒酵母中基因在畢赤酵母中有交叉功能

2應(yīng)在含recA, endA突變的菌株如Top10F’中構(gòu)建質(zhì)粒

3AOX1mRNA的5‘末端在各多克隆位點(diǎn)都已標(biāo)注出。如需分析RNA，可計(jì)算插入基因mRNA的大小

4插入基因的終止密碼子或3‘AOX1序列可使翻譯有效終止，3‘AOX1序列終止密碼已標(biāo)注出

制作者：陳苗 商漢橋

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5在畢赤酵母及其它真核系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)了“AT富含區(qū)”導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄提前終止。如果表達(dá)蛋白時(shí)出現(xiàn)問(wèn)題，應(yīng)檢查是否是提前終止及AT富含區(qū)。如要表達(dá)基因則需改變基因序列。

6Ppic9k中預(yù)測(cè)的蛋白酶裂解位點(diǎn)如圖（p28）所示

7插入成熟基因的開(kāi)放閱讀框，應(yīng)克隆進(jìn)α-factor信號(hào)序列讀碼框的下游

一般克隆策略：

1連接適合的限制性片段

A直接插入MCS上兩個(gè)不同位點(diǎn)

B利用相同的限制性末端，將片段連入單個(gè)合適位點(diǎn)

2PCR擴(kuò)增插入基因以產(chǎn)生合適的用于連入合適載體的限制性末端

3擴(kuò)增含目的基因片段通過(guò)TA克隆盒進(jìn)行直接克隆，再將合適的片段亞克隆進(jìn)所選擇載體

克隆程序：

注意：如果你要插入pAO815上EcoRI位點(diǎn)，而基因中也含有EcoRI位點(diǎn)，我們建議：

1BsaI可識(shí)別以下的限制性識(shí)別位點(diǎn)：

5‘GGTCTCN/

3‘CCAGAGNNNNN/

2將EcoRI位點(diǎn)改造成BsaI可識(shí)別位點(diǎn)

5‘GGTCTCG/AATTC……

3‘CCAGAGCTTAA/G……

3將該序列通過(guò)PCR整合進(jìn)DNA片段中，或在體外制造其它限制性位點(diǎn)的適配子接頭

4用BsaI消化PCR產(chǎn)物或適配連接產(chǎn)物，這樣不用EcoRI消化就可產(chǎn)生EcoRI的限制性末端。

信號(hào)序列加工：Ppic9k中α-factor成熟信號(hào)序列加工分兩步：

1KEX2基因產(chǎn)物初步切割信號(hào)序列，在 Glu-lys-arg*glu-ala-glu-ala中星號(hào)位置即arg及glu之間出現(xiàn)Kex2斷裂

2STE13基因產(chǎn)物接著切割Glu-Ala重復(fù)序列

優(yōu)化信號(hào)切割：釀酒酵母中，Glu-Ala重復(fù)序列并不是Kex2切割時(shí)的必需序列，但Glu-Ala重復(fù)序列可使該切割更有效。

Glu-Lys-Arg-X-序列中，在X位置上有許多氨基酸都可替代Glu，如芳香族氨基酸，小氨基酸及組氨酸。但脯氨酸會(huì)抑制Kex2的切割。

許多情況下，Stel13切割Glu-Ala重復(fù)片段效率不高，Glu-Ala重復(fù)序列就留在了表達(dá)的目的蛋白的N端，這一般與目的蛋白本身性質(zhì)有關(guān)。

細(xì)菌轉(zhuǎn)化：一旦確定克隆策略，在進(jìn)行連接反應(yīng)前應(yīng)制備好感受態(tài)，可參考電感受態(tài)或化學(xué)感受態(tài)方法或使用本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)程序。

Ppic9k的pAOX1及MCS:

特殊考慮：

1目的片段必須克隆進(jìn)分泌信號(hào)序列開(kāi)放閱讀框中

2信號(hào)序列中含ATG，翻譯從離mRNA5‘端最近的一個(gè)ATG開(kāi)始

3如果插入片段中有BglII位點(diǎn)，畢赤酵母轉(zhuǎn)化時(shí)，可選取其它限制性位點(diǎn)來(lái)線性化質(zhì)粒(P30)

制作者：陳苗 商漢橋

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轉(zhuǎn)化：

介紹：連接反應(yīng)之后，要通過(guò)化學(xué)或電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞(Top10F’或相似菌株)

轉(zhuǎn)化分析：

1轉(zhuǎn)化后，將轉(zhuǎn)化混合物涂在含50-100ug/ul Amp的LB平板上，選擇Amp抗性克隆

2挑取10個(gè)Amp抗性轉(zhuǎn)化子，接種含50-100ug/ul Amp的培養(yǎng)基，37度振蕩培養(yǎng)過(guò)夜

3小量制備分離質(zhì)粒DNA用于分析及測(cè)序。pAO815或pPIC3.5k測(cè)序時(shí)，用5‘AOX1及3‘AOX1測(cè)序引物；pPIC9k測(cè)序時(shí)，用α-factor引物及3’AOX1測(cè)序引物。將引物重懸于20ul滅菌水中，制成0.1ug/ul溶液。

4在0.85ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液中加入0.15ml滅菌甘油，以便保存所需克隆，渦旋混勻轉(zhuǎn)入標(biāo)記好的儲(chǔ)存管中。在液氮或干冰/酒精浴中冷凍后移入-70度保存。

5測(cè)序證實(shí)結(jié)構(gòu)正確后，可準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化DNA

重組克隆測(cè)序：強(qiáng)烈建議轉(zhuǎn)化畢赤酵母前進(jìn)行測(cè)序

1正確讀碼框(分泌表達(dá))

2真核翻譯起始所需的ATG正確的上下文

制作者：陳苗 商漢橋

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克隆基因后：克隆進(jìn)pAO815后，需在體外構(gòu)建多插入子

如果克隆進(jìn)Ppic3.5k或Ppic9k，可準(zhǔn)備將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入畢赤酵母。轉(zhuǎn)p28

準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化DNA：你應(yīng)該已經(jīng)獲得正確插入目的基因的畢赤酵母表達(dá)載體質(zhì)粒，以用于表達(dá)。下表列出下階段應(yīng)做的實(shí)驗(yàn)。

步驟

1

2

3

4

5

6

7

8

實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用DNA

GS115或KM71用于制備去壁細(xì)胞

DNA轉(zhuǎn)化GS115或KM71

選擇His+轉(zhuǎn)化子

如果將基因克隆進(jìn)Ppic3.5k或Ppic9k，篩選His+轉(zhuǎn)化子的遺傳霉素抗性

證實(shí)重組菌的Mut+Muts表型

PCR鑒定基因是否存在

檢測(cè)基因表達(dá)

頁(yè)數(shù)

28-30

31-34

35-36

35

37-40

41-43

70-71

44-48

建議同時(shí)分離His+Mut+及His+Muts畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，因?yàn)楹茈y預(yù)測(cè)哪種結(jié)構(gòu)更利于蛋白表達(dá)。通過(guò)線性化DNA 5‘AOX1區(qū)或HIS4基因及使用GS115（Mut+） 或KM71（Muts）菌株，可方便地分離到Mut+及 Muts重組子。每次轉(zhuǎn)化時(shí)使用約10ug線性化DNA。

質(zhì)粒DNA準(zhǔn)備：用于畢赤酵母轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA起碼純到可以做酶切，DNA越純，轉(zhuǎn)化效率越高。建議用S.N.A.P MiniPrep Kit來(lái)準(zhǔn)備質(zhì)粒DNA用于常規(guī)畢赤酵母轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒DNA也可通過(guò)堿裂解、酚：氯仿抽提及乙醇沉淀來(lái)獲得。

線性化質(zhì)粒DNA：建議使用下列方法線性化載體以獲得Mut+及 Muts重組子，可能其中一個(gè)會(huì)比另一個(gè)更利于表達(dá)多拷貝重組子。如果只想得到Muts重組子，使用KM71菌株。單個(gè)十字交換事件可比雙重十字交換更容易、更有效地獲得Muts重組菌（例如：插入AOX1或his4而不是取代AOX1）。如果插入片段含有下列任何限制性位點(diǎn)，見(jiàn)p29-30以替換位點(diǎn)。

1如果克隆進(jìn)Ppic3.5k，線性化時(shí)，

插入AOX1用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

插入HIS4用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

2如果克隆進(jìn)pAO815，線性化時(shí)，

插入HIS4用SalI或StuI（GS115, Mut+ 或KM71, Muts）

注意如果用pAO815載體，插入2個(gè)或更多拷貝子會(huì)產(chǎn)生SacI酶切位點(diǎn)

3如果克隆進(jìn)Ppic9k，線性化時(shí)，

插入AOX1用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

插入HIS4用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

程序：

1酶切新構(gòu)建載體及親本載體。將親本載體轉(zhuǎn)入GS115或KM71用作表達(dá)的背景對(duì)照

2凝膠分析酶切產(chǎn)物以確定是否酶切完全。如酶切不完全，轉(zhuǎn)化數(shù)及靶向效率都會(huì)降低

3用酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提酶切產(chǎn)物，乙醇沉淀DNA，用10-20ulTE緩沖液重懸。不需要將目的基因片段從線性化質(zhì)粒中分離純化出來(lái)。

4貯存于-20度直至轉(zhuǎn)化

替換酶切位點(diǎn)：下表列出線性化載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母時(shí)的可替換酶切位點(diǎn)。

注意Ppic9k中Kan基因中含StuI位點(diǎn)，而HIS4上的StuI位點(diǎn)則被去除。

制作者：陳苗 商漢橋

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對(duì)照：建議轉(zhuǎn)化畢赤酵母時(shí)用以下對(duì)照：

1親代載體與重組載體以相同方式進(jìn)行酶切，可在用PCR證實(shí)整合時(shí)作對(duì)照，還有表達(dá)分析及定量dot blot或southern分析時(shí)作為背景對(duì)照。

2含有單拷貝目的表達(dá)盒的pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k。以與多拷貝子同樣方式線性化pAO815載體。

大多數(shù)通過(guò)轉(zhuǎn)化重組Ppic3.5k或Ppic9k而得到的His+重組子只含有單拷貝插入。確保你挑取的轉(zhuǎn)化子只能抗0.25mg/ml遺傳霉素。pAO815、Ppic3.5k及Ppic9k單拷貝對(duì)照應(yīng)與正檢測(cè)的假定多拷貝重組子具有相同的Mut表型。這些單拷貝重組子可作為與多拷貝子進(jìn)行表達(dá)比較的參照，也可作為定量dot blot及southern分析時(shí)的參照。這是非常重要的參數(shù)，因?yàn)槟康幕蚩截悢?shù)的增加并不一定會(huì)增加重組蛋白的表達(dá)量。

培養(yǎng)畢赤酵母用于制作原生質(zhì)細(xì)胞：

介紹：一般，對(duì)大多數(shù)的研究者來(lái)說(shuō)，原生質(zhì)細(xì)胞及電轉(zhuǎn)是效率最高的轉(zhuǎn)化方法（103-104轉(zhuǎn)化子/ugDNA）。畢赤酵母同樣可用PEG1000（P68）或LiCl（P69）進(jìn)行轉(zhuǎn)化。這兩種方法，特別是LiCl方法不如原生質(zhì)法及電轉(zhuǎn)化方法。如果沒(méi)有電轉(zhuǎn)化裝置，建議使用原生質(zhì)細(xì)胞法或PEG1000法。畢赤酵母的轉(zhuǎn)化效率不如釀酒酵母的轉(zhuǎn)化效率高。

原生質(zhì)細(xì)胞的解釋?zhuān)寒叧嘟湍讣?xì)胞壁阻止攝入DNA，有必要去除部分細(xì)胞壁以吸收DNA。藤黃節(jié)桿菌酶是一種葡聚糖酶，可在細(xì)胞壁水解葡聚糖的β－1,3接頭，還可部分地消化細(xì)胞壁。該方法的關(guān)鍵在于不能過(guò)度消化細(xì)胞壁，否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。藤黃節(jié)桿菌酶消化能力受細(xì)胞對(duì)SDS敏感性的影響。等量細(xì)胞加入SDS，以產(chǎn)生原生質(zhì)細(xì)胞，該步的結(jié)果是溶液變澄清，其澄清度可由800nm處的吸光值獲得。

一般經(jīng)驗(yàn)，獲得70%原生質(zhì)細(xì)胞時(shí)，消化程度較好。用等滲溶液清洗細(xì)胞除去酶并與DNA共孵育。將細(xì)胞重懸于山梨醇溶液中，細(xì)胞壁再生后再鋪板。

準(zhǔn)備：制備下列溶液，存于4度。

YPD（Yeast Extract Peptone Dextro）培養(yǎng)基 1L

YPD平板 1L

RDB（Regeneration Dextro Ba） 平板 1L

RDHB（Regeneration Dextro Histidine Ba） 平板 1L

轉(zhuǎn)化當(dāng)天，配制下列試劑：存于4度

5% SDS溶液

制作者：陳苗 商漢橋

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RD（Regeneration Dextro） 融化瓊脂 100ml

溶液：細(xì)胞去壁及轉(zhuǎn)化試劑

1M 山梨醇

SE: 1M 山梨醇, 25mM EDTA pH8.0

DTT: 用水配制成1M濃度

SCE： 1M 山梨醇, 1mM EDTA , 10mM 檸檬酸鈉緩沖液 pH5.8

CaS: 1M 山梨醇, 10mM Tris-HCl pH7.5, 10mM CaCl2

藤黃節(jié)桿菌酶：用水配制成3mg/ml的濃度

40%PEG：用水配制40%（w/v）PEG3350(試劑純)

CaT: 20mM Tris pH7.5, 20mM CaCl2

SOS: 1M山梨醇, 0.3×YPD, 10mM CaCl2

每次轉(zhuǎn)化時(shí)配制：

SED：19mlSE加1ml 1M DTT

PEG/CaT: 1:1混合40%PEG及CaT

程序：

1在YPD平板上劃線培養(yǎng)GS115或KM71,28－30度培養(yǎng)2天，以得到分散的單克隆。

2在50ml離心管或100ml搖瓶中，從GS115或KM71平板上挑取單個(gè)克隆接種10ml

YPD，28－30度劇烈振蕩（250-300rpm）過(guò)夜。該培養(yǎng)基可在4度保存數(shù)天。

3在3個(gè)500ml培養(yǎng)瓶中加入200mlYPD，分別取5、10及20ul第2步中的細(xì)胞，于28-30度劇烈振蕩（250-300rpm）過(guò)夜

4第二天早上，將試劑盒中的轉(zhuǎn)化溶液（SE，SCE，滅菌水，SOS，PEG，CaS,1M山梨醇），RDB平板（用于轉(zhuǎn)化）、RDHB平板（活力對(duì)照），放置于室溫下。

5測(cè)每個(gè)培養(yǎng)瓶中的OD600值

6收集OD600值為0.2-0.3瓶中的細(xì)胞，室溫，1500g離心5-10min。去除上清，接下去準(zhǔn)備細(xì)胞去壁

注意：如果培養(yǎng)基都超過(guò)0.3，選擇一個(gè)培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基以1：4稀釋?zhuān)?8-30度孵育直至OD600值至0.2-0.3（2-4小時(shí)）。收集細(xì)胞如第6步

準(zhǔn)備細(xì)胞去壁：取得上述第6步細(xì)胞

1取100ml融化的RD瓊脂糖，存于45度

2解凍1管1M DTT

3為該次去壁細(xì)胞試驗(yàn)準(zhǔn)備新鮮的SED

無(wú)菌條件下，將19mlSE轉(zhuǎn)入合適的滅菌容器中（如50ml離心管），加1ml 1M DTT混合均勻，為得到最好的效果，SED現(xiàn)配現(xiàn)用

注意：DTT的質(zhì)量及新鮮度是成功制備去壁細(xì)胞的關(guān)鍵，1M DTT分析純，-20度保存。

洗滌細(xì)胞：

1用20ml滅菌水懸浮洗滌細(xì)胞，轉(zhuǎn)入滅菌的50ml的離心管中

2室溫1500g 離心5min，收集細(xì)胞

3將細(xì)胞重懸于20ml新鮮的SED中洗滌，如2離心

4用20ml 1M 山梨醇洗滌，離心如2

制作者：陳苗 商漢橋

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5用20ml SCE緩沖液重懸細(xì)胞，將懸液分至兩個(gè)50 ml離心管中(10ml/管)

6取1管藤黃節(jié)桿菌酶置于冰上，輕彈管壁以混勻，藤黃節(jié)桿菌酶以漿液的形式存在，無(wú)需配成溶液，將它混勻以確保每次的量是相等的。

加入藤黃節(jié)桿菌酶：可先取一管細(xì)胞來(lái)確定用藤黃節(jié)桿菌酶消化細(xì)胞的最佳時(shí)間，一旦確定時(shí)間，取另一管細(xì)胞進(jìn)行裂解。藤黃節(jié)桿菌酶消化細(xì)胞壁，使細(xì)胞變脆，拿樣品時(shí)要輕柔些，加入藤黃節(jié)桿菌酶后，即開(kāi)始消化細(xì)胞壁。

*準(zhǔn)備至少20ml 5%SDS溶液

*將分光光度計(jì)調(diào)至800nm處，用800ul 5%SDS及200ul SCE作空白

*準(zhǔn)備10個(gè)滅菌離心管，編號(hào)0，2，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，45，50

1取5步中一管細(xì)胞，取出200ul加入標(biāo)0的管中，置于冰上，此即0點(diǎn)

2加7.5ul藤黃節(jié)桿菌酶到該管剩余細(xì)胞中，輕輕顛倒混勻，30度孵育，不要晃動(dòng)樣品。該樣品可用于建立細(xì)胞去壁最佳時(shí)間表。將另一管細(xì)胞置于室溫，用于第六步。將剩余藤黃節(jié)桿菌酶放于冰上。

3監(jiān)測(cè)去壁細(xì)胞的形成：2min時(shí)，取200ul步驟2中的懸浮細(xì)胞，加入標(biāo)2的管中。在t=4,5,6,,,50min時(shí)，重復(fù)上述操作，讀樣品OD800值

4用公式確定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)去壁細(xì)胞的形成比例：

%去壁率=100-［(時(shí)間t時(shí)OD800值/時(shí)間0時(shí)OD800值)×100］

如t=0時(shí)，OD800=0.256， t=15時(shí)，OD800=0.032

計(jì)算：%去壁率=100-［(0.032/0.256)×100］=100-［(0.125)×100］=100-12.5=87.5%

5確定去壁率為70%時(shí)的時(shí)間，藤黃節(jié)桿菌酶的用量不同，最佳時(shí)間也各不相同。Invitrogen 實(shí)驗(yàn)室的最佳去壁時(shí)間為15-40min。

注意：確定獲得所需量去壁細(xì)胞的最小時(shí)間很重要，藤黃節(jié)桿菌酶消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞有害，效率會(huì)降低。

6在另一管中加入7.5ul藤黃節(jié)桿菌酶(如步驟1)，將管放于30度，時(shí)間為步驟5中建立的最佳時(shí)間，以獲得最佳比例70%的去壁細(xì)胞。

7室溫750g離心10min，收集去壁細(xì)胞，去除懸浮液

8用1M山梨醇洗去壁細(xì)胞1次(輕叩管壁以分散去壁細(xì)胞團(tuán)，不要渦旋)。如上離心

9用10ml CaS洗滌去壁細(xì)胞，如7中離心，用0.6mlCaS重懸細(xì)胞。去壁細(xì)胞必須立即(至多30min)用于轉(zhuǎn)化。不能放更長(zhǎng)時(shí)間，這些細(xì)胞共可作6次轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)化畢赤酵母：

開(kāi)始前：將RDB平板放于室溫，準(zhǔn)備好融化的RD上層瓊脂，取出線性化DNA置于冰上

GS115中，用SalI,StuI或SacI線性化的DNA可分離His+Mut+重組子

KM71中，用SalI,StuI或SacI線性化的DNA可分離His+Muts重組子

親代載體用相同酶線性化

對(duì)照包括無(wú)DNA，線性化PBR322DNA及質(zhì)粒(無(wú)細(xì)胞)涂板來(lái)檢測(cè)是否有污染

程序：

1取上述9中100ul去壁細(xì)胞到1.5 ml滅菌的有蓋管中

2取10ugDNA，室溫孵育10min

3同時(shí)配制PEG/CaT溶液，計(jì)算所需用量，加入等量的40%PEG/CaT(1:1)

4加1ml新鮮的PEG/CaT溶液至細(xì)胞與DNA混合物中，輕輕混勻，室溫孵育10min

制作者：陳苗 商漢橋

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5室溫750g離心10min，小心抽吸PEG/CaT溶液，顛倒管，輕叩管壁以排出多余的PEG/CaT溶液。

6用150ulSOS培養(yǎng)基懸浮轉(zhuǎn)化細(xì)胞，室溫孵育20min

7加入850ul1M山梨醇，接下來(lái)涂板

涂板：畢赤酵母去壁細(xì)胞需要鋪在頂層瓊脂糖或瓊脂上，以防止在選擇前被裂解

1接第7步，取100-300ul去壁細(xì)胞-DNA，與10ml融化的RD瓊脂糖混勻倒于RDB平板上，直至上層瓊脂變硬。注意，確保有足夠的去壁細(xì)胞-DNA鋪第二板，第三板

2倒置平板，28-30度孵育，轉(zhuǎn)化子會(huì)在4-6天內(nèi)出現(xiàn)

3細(xì)胞活性：用100ul去壁細(xì)胞加入900ul 1M山梨醇

4取稀釋樣本100ul，加入10ml融化的RDH，鋪在RDHB平板上，等上層瓊脂凝固

5倒置平板，28-30度孵育，4-6天出現(xiàn)克隆，表明去壁細(xì)胞可再生成分裂細(xì)胞

His+轉(zhuǎn)化子分析：如用Ppic3.5k及Ppic9k構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，接著做體內(nèi)篩選多插入子

如用pAO815構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，篩選Mut+及Muts轉(zhuǎn)化子

評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)：使用去壁細(xì)胞，一般轉(zhuǎn)化效率為103-104His+轉(zhuǎn)化/ugDNA，在無(wú)DNA、線性化PBR322及只有質(zhì)粒(無(wú)細(xì)胞)平板上應(yīng)均無(wú)克隆。

功能分析篩選：有些研究者通過(guò)功能分析直接檢測(cè)高表達(dá)畢赤酵母重組克隆，而不進(jìn)行Mut+及Muts表型篩選。檢測(cè)完高表達(dá)后，最好也檢測(cè)Mut表型，這可幫助你優(yōu)化重組克隆的表達(dá)。

體內(nèi)篩選多插入子：

介紹：His+轉(zhuǎn)化子越多越好，因?yàn)橹挥?-10%His+轉(zhuǎn)化子可能含有多拷貝插入。這意味著，如果多拷貝插入概率為1%，你必須篩選1000個(gè)克隆，才能得到10個(gè)高遺傳霉素抗性克隆，這需要1-5個(gè)含His+轉(zhuǎn)化子的平板。篩選數(shù)以千計(jì)的克隆并不罕見(jiàn)。如果有抗高遺傳霉素抗性的克隆，可檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)(P44)，或者檢測(cè)Mut表型(P41)。

篩選遺傳霉素抗性轉(zhuǎn)化子方法：

一、技術(shù)上簡(jiǎn)單，可篩選大量克隆，但不那么可信。篩選HIS+轉(zhuǎn)化子后，將它們集中起來(lái)，鋪在遺傳霉素濃度逐漸升高的YPD平板上，可應(yīng)用于去壁細(xì)胞及電轉(zhuǎn)化方法。

二、技術(shù)上較難，只可篩選少量克隆，但更可信。每個(gè)克隆在微量測(cè)定板上生長(zhǎng)至濃度一致，將培養(yǎng)基點(diǎn)到Y(jié)PD-遺傳霉素平板上計(jì)算抗遺傳霉素抗性。

注意：用遺傳霉素篩選可能會(huì)有假陽(yáng)性。劃線挑取假定的抗遺傳霉素單克隆，然后在YPD-遺傳霉素平板上進(jìn)行證實(shí)很重要。如果你真的選擇復(fù)制平板，一定要證實(shí)遺傳霉素抗性。

開(kāi)始前：準(zhǔn)備10個(gè)YPD平板，每個(gè)的遺傳霉素濃度為0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0及4.0mg/ml。

(去壁細(xì)胞)方法1：從含HIS+轉(zhuǎn)化子的平板開(kāi)始

1用滅菌刮片將含有HIS+轉(zhuǎn)化子的頂層瓊脂最上層刮下，放入無(wú)菌的50ml離心管中。

2加入10-20ml滅菌水，量應(yīng)為瓊脂的兩倍，劇烈振蕩1-2min

3將離心管置于管架上，讓瓊脂沉淀(1min)

4用血球計(jì)數(shù)計(jì)確定上清中細(xì)胞濃度。至少要5×105細(xì)胞/ml，那樣在200ul或更少溶液中可含105個(gè)細(xì)胞。(如果太稀，可將液體轉(zhuǎn)入另一管中，離心細(xì)胞，再用適量滅菌水重懸至5×105細(xì)胞/ml)

5每塊含遺傳霉素的YPD平板涂105細(xì)胞。每個(gè)濃度用四塊板。

制作者：陳苗 商漢橋

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(需要證實(shí)在沒(méi)有遺傳霉素的YPD板上細(xì)胞的滴度，計(jì)算每個(gè)遺傳霉素抗性平板上抗遺傳霉素克隆的比例，以確定你所得到的多拷貝子是否占平板上轉(zhuǎn)化子的1-10%，將收集的轉(zhuǎn)化子稀釋到10-5，10-6，10-7濃度，每板加100-200ul)

6在30度孵育平板，每天檢查。抗遺傳霉素克隆需2-5天出現(xiàn)，不含遺傳霉素的YPD平板上克隆需2-3天出現(xiàn)。接下來(lái)做結(jié)果分析。P39

(電轉(zhuǎn)化)方法1：電轉(zhuǎn)化畢赤酵母時(shí)用以下程序。轉(zhuǎn)化子不需要鋪在上層瓊脂。從含HIS+轉(zhuǎn)化子平板開(kāi)始。

1吸取1-2ml滅菌水于所有HIS+轉(zhuǎn)化子平板上

2用滅菌刮子重懸HIS+轉(zhuǎn)化子，不要?jiǎng)澠骗傊?

3將細(xì)胞懸液集中轉(zhuǎn)移至滅菌的50ml離心管中，稍渦旋(5-10S)

4用分光光度計(jì)測(cè)定濃度(1OD600=5×107細(xì)胞/ml)

注意：混有瓊脂會(huì)干擾讀數(shù)

5在每塊含有遺傳霉素的YPD平板上涂105細(xì)胞。

(需要證實(shí)在沒(méi)有遺傳霉素的YPD板上細(xì)胞的滴度，計(jì)算每個(gè)遺傳霉素抗性平板上抗遺傳霉素克隆的比例，以確定你所得到的多拷貝子是否占平板上轉(zhuǎn)化子的1-10%，將收集的轉(zhuǎn)化子稀釋到10-5，10-6，10-7濃度，每板加100-200ul)

6在30度孵育平板，每天檢查。抗遺傳霉素克隆需2-5天出現(xiàn)，不含遺傳霉素的YPD平板上克隆需2-3天出現(xiàn)。接下來(lái)做結(jié)果分析。P39

注意：如果在以上方法里你將所有細(xì)胞都懸浮，加15%滅菌甘油，存于-80度，可在以后時(shí)間里做遺傳霉素抗性篩選。

方法2：需要三組各兩塊微量測(cè)定板(共6塊)來(lái)篩選180個(gè)HIS+重組子。通過(guò)持續(xù)接種，得到相同濃度的克隆子，以確保遺傳霉素平板上細(xì)胞數(shù)相等。如將轉(zhuǎn)化子鋪于頂層瓊脂中，有必要從瓊脂上收集細(xì)胞，重新涂最小組氨酸平板(P42)以收集克隆。記住要有菌株背景對(duì)照及單拷貝基因?qū)φ铡Ｃ?80個(gè)克隆，可選擇出1-10個(gè)抗遺傳霉素克隆。

1無(wú)菌條件下，在每個(gè)微量測(cè)定板上加入200ul YPD

2用滅菌牙簽在第一組平板中每孔接種單個(gè)HIS+轉(zhuǎn)化子，輕輕攪動(dòng)以懸浮細(xì)胞

3蓋住微量測(cè)定板在30度孵育2天(不需搖動(dòng))

4 2天后，取新的微量測(cè)定板，加入190ulYPD

5用多道移液器吸取10ul培養(yǎng)液于第二組測(cè)定板中，確保第二組板標(biāo)記好并放置好，這樣可指示細(xì)胞所在孔。

6蓋住第二組板，30度孵育過(guò)夜

7第二天，在第三組測(cè)定板上重復(fù)第5,6步

注意：持續(xù)生長(zhǎng)及傳代可使克隆達(dá)到相同細(xì)胞濃度

8孵育后，取第三組板，用100ul多道移液器上下吹打重新懸浮細(xì)胞

9取10ul每孔中液體點(diǎn)在含遺傳霉素濃度為0，0.25，0.5……4.0mg/ml的YPD平板上。用多道移液器或在平板底下劃線，確保以規(guī)則方式排列。

10待液體吸收，將板放于30度，2，3，4，5天后檢測(cè)抗遺傳霉素克隆，接著分析結(jié)果。

結(jié)果分析：可能只有少數(shù)的抗遺傳霉素克隆，大小可能也不一樣，但克隆形態(tài)上應(yīng)一致。挑取抗遺傳霉素克隆，劃線培養(yǎng)純化，挑取單克隆，確保記錄抗遺傳霉素的水平。

可能在2.0，3.0，4.0mg/ml遺傳霉素平板上找不到克隆，因?yàn)榭谷绱烁哌z傳霉素的“頭彩”克隆很少見(jiàn)。需要篩選數(shù)以千計(jì)的HIS+轉(zhuǎn)化子以分離抗2-4mg/ml遺傳霉素的克隆。

因?yàn)椴荒鼙ＷC多拷貝克隆會(huì)確實(shí)增加蛋白表達(dá)量，許多人選擇直接表達(dá)來(lái)看是否有克隆制作者：陳苗 商漢橋

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可大量表達(dá)蛋白。確保有單拷貝插入作為對(duì)照，檢測(cè)所有抗遺傳霉素抗性克隆的Mut表型(P41)，以期進(jìn)行正確誘導(dǎo)表達(dá)。

確保劃線純化單克隆，并加入甘油冰凍保存遺傳霉素抗性克隆，每次從凍存樣本中挑菌開(kāi)始表達(dá)研究而不是從老的平板上挑菌。

確定拷貝數(shù)目：如果發(fā)現(xiàn)抗遺傳霉素HIS+重組子明顯大量表達(dá)蛋白，你可能想要知道基因拷貝數(shù)。可用southern blot 或dot blot 分析拷貝數(shù)(P74)。轉(zhuǎn)化空載體或含單拷貝基因載體的畢赤酵母重組菌基因組DNA也非常重要，可作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照。

解決問(wèn)題：因?yàn)橛锌赡芴羧〖訇?yáng)性(看起來(lái)可抗高濃度遺傳霉素，其實(shí)并不是)，純化假定的遺傳霉素抗性克隆，并證實(shí)其所抗遺傳霉素的水平非常重要。

體內(nèi)方法另一個(gè)普遍的問(wèn)題是，只能分離少數(shù)遺傳霉素抗性克隆，這意味著需要篩選更多的HIS+轉(zhuǎn)化子。記住你正分離的多拷貝插入事件，它發(fā)生的概率為1-10%，這意味著需篩選數(shù)以千計(jì)的克隆而不是區(qū)區(qū)幾百個(gè)。另外，為分離含較多拷貝插入基因的重組子，需要篩選更多的HIS+轉(zhuǎn)化子。連續(xù)的多拷貝插入更是少見(jiàn)。

如果你的轉(zhuǎn)化效率很低，嘗試用電轉(zhuǎn)化替代去壁細(xì)胞方法。這樣可增加轉(zhuǎn)化效率，幫助你分離更多HIS+轉(zhuǎn)化子。

篩選Mut+及Muts 轉(zhuǎn)化子

介紹：此處，你可分析HIS+轉(zhuǎn)化子的Mut+及Muts表型。試劑盒中有兩個(gè)菌株可提供Mut+及Muts表型對(duì)照。GS115 Albumin是Muts表型，GS115 β-gal是Mut+表型。HIS+ KM71重組子不需要篩選重組子表型，因?yàn)樗鼈兌际荕uts表型。

記住要用兩個(gè)對(duì)照菌株作為畢赤酵母蛋白表達(dá)的背景：一個(gè)對(duì)照即親本質(zhì)粒線性化產(chǎn)生HIS+ Muts轉(zhuǎn)化子，另一個(gè)對(duì)照是親本質(zhì)粒線性化產(chǎn)生HIS+ Mut+轉(zhuǎn)化子。

在GS115中篩選HIS+ Mut+轉(zhuǎn)化子：用SalI或StuI線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GS115后，大多在HIS4位點(diǎn)上發(fā)生重組，大多數(shù)轉(zhuǎn)化子是Mut+表型；然而由于質(zhì)粒含有AOX1基因序列，有可能在AOX1位點(diǎn)發(fā)生重組，破壞野生型AOX1基因，產(chǎn)生HIS+ Muts轉(zhuǎn)化子(P66)。在MD及MM平板上檢測(cè)可證實(shí)HIS+ Mut+轉(zhuǎn)化子。

在KM71中篩選HIS+ Muts轉(zhuǎn)化子:轉(zhuǎn)化KM71的HIS+轉(zhuǎn)化子都是Muts，因?yàn)锳OX1基因被破壞(aox::ARG4)。不需要檢測(cè)重組子Mut表型，所有都是Muts。SalI或StuI線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化KM71在HIS4位點(diǎn)重組，SacI線性化質(zhì)粒在AOX1基因5’區(qū)重組。HIS+重組子需在不含組氨酸的平板上純化后再進(jìn)行表達(dá)。

準(zhǔn)備：下列培養(yǎng)基可提前準(zhǔn)備存于+4度

最小葡萄糖(MD)瓊脂板 1L

最小甲醇(MM)瓊脂板 1L

滅菌牙簽及篩選平板 (P43)

在MD，MGY平板上劃線培養(yǎng)GS115 Ablumin(HIS+ Muts)及GS115β-gal HIS+ Mut+，作為Mut+或 Muts在MD或MM平板上生長(zhǎng)的對(duì)照。

篩選GS115/HIS+ Mut+ 或HIS+ Muts：篩選HIS+轉(zhuǎn)化子的Mut+或 Muts表型

1用滅菌牙簽挑取單克隆，在MM及MD平板上以一定的方式劃線或點(diǎn)HIS+轉(zhuǎn)化子，確保先在MM平板上點(diǎn)

2每個(gè)克隆換一次牙簽，點(diǎn)100個(gè)轉(zhuǎn)化子后再繼續(xù)向下做(約2-3板)

3為分離Mut+及Muts表型，在MD及MM平板上各點(diǎn)上對(duì)照(GS115/HIS+ Muts Ablumin及GS115/ HIS+ Mut+β-gal)

4 30度孵育2天

制作者：陳苗 商漢橋

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5兩天后，計(jì)數(shù)平板，尋找在MD平板正常生長(zhǎng)而在MM平板上生長(zhǎng)很小或不長(zhǎng)的菌株。

注意：建議純化HIS+轉(zhuǎn)化子，確保分離的是單克隆，這可在檢測(cè)Mut表型前后進(jìn)行。

復(fù)制平板程序：該程序錯(cuò)誤分離的概率較小，但分離的程序要增加2天，需要儀器復(fù)制平板。

制作者：陳苗 商漢橋

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1用滅菌牙簽，在MD平板上(2-3板) 點(diǎn)100個(gè)HIS+轉(zhuǎn)化子，點(diǎn)GS115/HIS+ Muts Ablumin及GS115/ HIS+ Mut+β-gal在MD上作對(duì)照。

2在28-30度孵育2天

3兩天后，復(fù)制平板至新鮮的MM、MD平板，篩選Muts

4 28-30度孵育復(fù)制平板2天

5在28-30度孵育兩天后，計(jì)數(shù)復(fù)制平板，查找在MD平板上正常生長(zhǎng)而在MM平板上長(zhǎng)得小或不長(zhǎng)的菌落。每塊板上的HIS+Mut s及 HIS+Mut+對(duì)照菌落，可作為Muts及 Mut+表型的參照。

轉(zhuǎn)化子更簡(jiǎn)單的選擇方法：由于鋪在上層瓊脂，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化子中有些在上層有些則包埋在瓊脂里，無(wú)法挑取克隆。下列程序可進(jìn)行轉(zhuǎn)化子選擇，直接將它們鋪于板上，而無(wú)需用上層瓊脂。

1用滅菌刮子刮取含HIS+轉(zhuǎn)化子的瓊脂置于滅菌的50ml離心管中，加入20ml滅菌去離子水，劇烈渦旋重懸細(xì)胞

2用4層干酪包布過(guò)濾上清，室溫1000g離心5min。細(xì)胞在底部，殘留的瓊脂在細(xì)胞上方

3仔細(xì)去除瓊脂，輕輕晃動(dòng)管子，使瓊脂顆粒分散于水中，棄去含瓊脂的上清。

4用5ml滅菌去離子水重懸細(xì)胞，用小超聲頭，20-30%輸出功率下超聲細(xì)胞10秒，只將細(xì)胞超聲分散而不是裂解細(xì)胞。

5將細(xì)胞稀釋至104，在MD平板上鋪50-100ul。30度孵育過(guò)夜。選擇方法進(jìn)行Mut表型篩選。

重組酵母菌表達(dá)：

介紹：確定目的基因表達(dá)的最優(yōu)方法及條件，下面為畢赤酵母表達(dá)因素及指導(dǎo)，因?yàn)閷?duì)于任何表達(dá)系統(tǒng)，最優(yōu)化條件因表達(dá)蛋白的特征而不同。

培養(yǎng)基：需要BMGY/BMMY(緩沖復(fù)合甘油或緩沖復(fù)合甲醇培養(yǎng)基)BMG/BMM(緩沖最小甘油或緩沖最小甲醇培養(yǎng)基)MGY/MM(最小甘油或最小甲醇培養(yǎng)基)進(jìn)行表達(dá)(P60)。BMG,BMM,BMGY,BMMY用于分泌蛋白表達(dá)，特別是當(dāng)PH對(duì)蛋白活性比較重要時(shí)。它們是緩沖培養(yǎng)基，這與MGY、 MM不同。這四種培養(yǎng)基用磷酸鹽緩沖，PH值在一個(gè)較大的范圍內(nèi)，可用于蛋白優(yōu)化表達(dá)。BMGY/BMMY含酵母浸出物及蛋白胨，可穩(wěn)定分泌蛋白，阻止或減少分泌蛋白的分解。酵母浸出物及蛋白胨作為“混合飼料”，使生長(zhǎng)更好并可積累大量表達(dá)產(chǎn)物。

蛋白酶：有些蛋白特別易受在中性PH值時(shí)有很好活性的蛋白酶的影響。在這種情況下，建議用MGY，MM培養(yǎng)基，因?yàn)楫?dāng)畢赤酵母在無(wú)緩沖培養(yǎng)基如MM中表達(dá)時(shí)，PH降至3或更低，許多中性PH蛋白酶都將失活。畢赤酵母對(duì)低PH值有抗性，因此低PH值不會(huì)影響生長(zhǎng)。與此相對(duì)的是，有報(bào)道稱(chēng)加入1%酪蛋白氨基酸(Difco)并將培養(yǎng)基PH值緩沖至6.0，胞外蛋白酶受抑制，增加了小鼠表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)。

如果你的目的蛋白對(duì)中性PH蛋白酶敏感的話，可在無(wú)緩沖培養(yǎng)基(MM)中表達(dá)。如果沒(méi)有證據(jù)證明你的分泌蛋白對(duì)中性PH值蛋白酶敏感，建議開(kāi)始表達(dá)時(shí)用BMMY。如果表達(dá)蛋白降解了，嘗試在無(wú)緩沖培養(yǎng)基中進(jìn)行表達(dá)。

如果以上條件仍不能有效防止蛋白降解，可將基因轉(zhuǎn)入SMD1168中，該菌株表型是his4pep4，缺失了蛋白酶，轉(zhuǎn)化與表達(dá)程序與GS115相同，也可用于大規(guī)模發(fā)酵。

制作者：陳苗 商漢橋

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換氣：畢赤酵母高效表達(dá)的重要因素是在甲醇誘導(dǎo)時(shí)充分換氣。基本上在誘導(dǎo)時(shí)，培養(yǎng)基不要超過(guò)搖瓶體積的10-30%。建議使用隔板搖瓶，用2-3層干酪包布或松散合適的蓋子蓋住搖瓶，不要用很緊的蓋子。(換氣在誘導(dǎo)前大量培養(yǎng)時(shí)并不那么重要)

生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)：當(dāng)Mut+及Muts在YPD或甘油培養(yǎng)基中生長(zhǎng)接近相同速度時(shí)，加入甲醇，由于AOX1基因產(chǎn)物的產(chǎn)生，Mut+將比Muts生長(zhǎng)快。

溫度及振蕩：所有表達(dá)需在30度的搖床中進(jìn)行。溫度不能超過(guò)30度很重要，如果搖床溫度不穩(wěn)，設(shè)置在28度。使用落地式搖床，速度為225-250rpm，如果為臺(tái)式搖床，速度調(diào)至250-300rpm。

開(kāi)始前：先證實(shí)重組子及對(duì)照重組子(無(wú)插入，1拷貝插入)在GS115或KM71中的表達(dá)情況。進(jìn)行表達(dá)時(shí)，選擇合適的對(duì)照很重要，可以更好地解釋你的表達(dá)結(jié)果。表達(dá)對(duì)照如下：

GS115/HIS+ Muts Ablumin Muts分泌表達(dá)對(duì)照

GS115/ HIS+ Mut+ β-gal Mut+胞內(nèi)表達(dá)對(duì)照

GS115或KM71/載體(無(wú)插入) 背景對(duì)照

GS115或KM71/載體(1拷貝插入) 單拷貝基因表達(dá)水平對(duì)照

不同的重組形式均會(huì)影響表達(dá)，建議挑取6-10個(gè)克隆進(jìn)行表達(dá)水平篩選。從最新的平板上挑取克隆。克隆子活力隨時(shí)間而下降，如果有任何懷疑，最好劃線純化菌株。(也可以從凍存的甘油菌中取部分進(jìn)行培養(yǎng))

表達(dá)指導(dǎo)：下面信息有關(guān)如何開(kāi)始表達(dá)，可能需要改變條件來(lái)表達(dá)不同蛋白，如可能使用底隔板或邊隔板搖瓶。如果分析許多重組子，可用50ml離心管。為確保有效換氣，可增加搖瓶速度或?qū)㈦x心管以一定角度置于搖床中。

Mut+胞內(nèi)或分泌表達(dá)：為檢測(cè)表達(dá)條件是否有效，可培養(yǎng)GS115β-gal (Mut+)(胞內(nèi)表達(dá)-半乳糖苷酶)。親代載體轉(zhuǎn)化GS115或KM71作為胞內(nèi)表達(dá)背景對(duì)照。

1挑取單克隆，接種至25mlMGY，BMG或BMGY中，(250ml搖瓶)，28-30度，250-300rpm搖至OD600=2-6(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，大約16-18小時(shí))

2室溫1500-3000g離心5min，收集細(xì)胞，去除上清，用MM，BMM或BMMY重懸細(xì)胞至OD600=1.0，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(大約100-200ml)

3在1L搖瓶中加入上述培養(yǎng)物，加蓋兩層滅菌紗布或干酪包布，放入搖床繼續(xù)生長(zhǎng)。

4每24小時(shí)，加甲醇至終濃度為0.5%以繼續(xù)誘導(dǎo)。檢查培養(yǎng)基的量，確保正確加入甲醇，因?yàn)檎舭l(fā)作用會(huì)減少培養(yǎng)基的體積。

5在下列的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取1ml培養(yǎng)基至1-5ml離心管。這些樣品用于分析表達(dá)水平及確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時(shí)間。室溫用水平離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心2-3min。時(shí)間點(diǎn)：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

6分泌表達(dá)時(shí)，將上清轉(zhuǎn)移至單獨(dú)管中，將上清及細(xì)胞沉淀存于-80度直至開(kāi)始檢測(cè)。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍

胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，去除上清將細(xì)胞沉淀存于-80度，直至開(kāi)始檢測(cè)。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍

7用考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法來(lái)分析上清及細(xì)胞沉淀的蛋白表達(dá)(SDS-PAGEp47)。

Muts胞內(nèi)或分泌表達(dá):可培養(yǎng)GS115 Ablumin (Muts，分泌白蛋白至培養(yǎng)基中)檢測(cè)培養(yǎng)條件的效率。記住要用轉(zhuǎn)化親本載體的GS115或KM71作為胞內(nèi)表達(dá)的背景對(duì)照。

制作者：陳苗 商漢橋

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1挑取單克隆，接種至含100mlMGY，BMG或BMGY的1L隔板搖瓶中。在搖床中28-30度，250-300rpm生長(zhǎng)至OD600=2-6(約16-18小時(shí))

2室溫1500-3000g離心5min收集細(xì)胞，去除上清，用1/5-1/10原培養(yǎng)基體積的MM，BMM或BMMY重懸細(xì)胞(約10-20ml)

3置于100ml隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住瓶口，放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)。

4每隔24小時(shí)，加入甲醇至終濃度為0.5%以繼續(xù)誘導(dǎo)。

5在下列的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取1ml培養(yǎng)基至1-5ml離心管。這些樣品用于分析表達(dá)水平及確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時(shí)間。室溫用水平離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心2-3min。時(shí)間點(diǎn)：0，6，12，24(1天)，36，48(2天)，60，72(3天)，84，96(4天)。

6分泌表達(dá)時(shí)，將上清轉(zhuǎn)移至單獨(dú)管中，將上清及細(xì)胞沉淀存于-80度直至開(kāi)始檢測(cè)。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍

胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，去除上清將細(xì)胞沉淀存于-80度，直至開(kāi)始檢測(cè)。在液N2或干冰/酒精浴中快速冷凍。

7用考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE，western blot或功能分析方法來(lái)分析上清及細(xì)胞沉淀的蛋白表達(dá)(SDS-PAGE p47)。

SDS-PAGE分析：

介紹：任何標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE儀器及程序均可用，如12%聚丙烯酰胺凝膠，5%濃縮膠用于分離40-100kDa蛋白。

樣品準(zhǔn)備：需要準(zhǔn)備Breaking 緩沖液(P60)及酸洗0.5mm玻璃珠

細(xì)胞洗滌準(zhǔn)備：(胞內(nèi)或分泌表達(dá))

1快速融化細(xì)胞沉淀，置于冰上

2每1ml樣品，加入100ul裂解緩沖液(細(xì)胞+上清)

3加入等量的酸洗玻璃珠(0.5mm)，通過(guò)置換來(lái)估算相等體積

4渦旋30s，冰上孵育30s，重復(fù)8次

5 4度最大轉(zhuǎn)速離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至干凈的微量離心管中

6取50ul上清(細(xì)胞裂解物)，，加入50ul2×SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液(樣品buffer)

7煮沸10min,每孔加10-20ul，依膠的厚薄及孔量，決定點(diǎn)樣量。剩下樣品存于-20度，用于western blot。細(xì)胞裂解物存于-80度用于分析。

蛋白濃度：Lowry,BCA(pierce)或Bradford蛋白分析可用于定量分析細(xì)胞裂解物中及培養(yǎng)基上清中蛋白量。一般，畢赤酵母細(xì)胞裂解物含有5-10ug/ul蛋白。畢赤酵母培養(yǎng)基上清中蛋白含量各有不同，基本上與分泌蛋白的量有關(guān)。畢赤酵母只分泌很少自身蛋白，如果培養(yǎng)基中蛋白量大于50ug/ml，10ul培養(yǎng)基在SDS-PAGE上通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色可得一條弱帶。

對(duì)照：在SDS-PAGE上用下列樣品作對(duì)照：

1與所需蛋白相適的分子量標(biāo)準(zhǔn)

2標(biāo)準(zhǔn)蛋白(如果有的話)

3含親本載體的GS115或KM71樣品，這可顯示畢赤酵母胞內(nèi)自身蛋白背景，如果在胞內(nèi)表達(dá)，可幫助你將目的蛋白從背景蛋白中區(qū)分開(kāi)來(lái)

4分析GS115β-gal 及Ablumin 對(duì)照，可指示培養(yǎng)基或條件是否有問(wèn)題

用考馬斯亮藍(lán)染色時(shí)，強(qiáng)烈建議進(jìn)行western blot或其它更敏感的分析方法來(lái)分析蛋白，表達(dá)蛋白依染色而呈現(xiàn)出來(lái)依靠多種因素，如表達(dá)水平，可溶性，分子量及胞內(nèi)相同分子量的蛋白是否掩蓋了它等等。Wetern blot,酶活分析或特定的純化方式，可幫助在自身蛋白中辨認(rèn)表達(dá)蛋白。

制作者：陳苗 商漢橋

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分析蛋白表達(dá)：檢查考馬斯亮藍(lán)染色SDS-PAGE時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)隨不同時(shí)間誘導(dǎo)產(chǎn)生目的蛋白與標(biāo)準(zhǔn)蛋白移行相同距離，如果沒(méi)有可見(jiàn)的重組蛋白，進(jìn)行western blot或功能分析。

*如果重組蛋白的表達(dá)量很低，見(jiàn)(畢赤酵母表達(dá)蛋白優(yōu)化)P49，優(yōu)化表達(dá)指導(dǎo)。

*用試劑盒自帶的兩個(gè)對(duì)照菌檢測(cè)表達(dá)條件

*如果沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)，進(jìn)行northern blot分析，看是否有及有多少被誘導(dǎo)的全長(zhǎng)mRNA。見(jiàn)P76，RNA分離程序。

優(yōu)化畢赤酵母蛋白表達(dá)：

介紹：根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，在畢赤酵母中表達(dá)可測(cè)水平外源蛋白的概率大約為75%。最大的障礙可能是最初的成功---表達(dá)任意水平蛋白，雖然表達(dá)≧10g/l的例子很少，仍有許多表達(dá)水平≧1g/l的例子，使得畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成為最高產(chǎn)的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。也有一些無(wú)法在桿狀病毒及釀酒酵母中表達(dá)而在畢赤酵母中成功表達(dá)的例子，表明畢赤酵母系統(tǒng)是一個(gè)很好的替代選擇，如果你最初沒(méi)有表達(dá)或很少的話，使用下列指導(dǎo)來(lái)優(yōu)化表達(dá)。

蛋白酶水解或降解：作一系列表達(dá)時(shí)間研究，檢測(cè)是否在某一個(gè)時(shí)間點(diǎn)產(chǎn)生較多比例的全長(zhǎng)蛋白。

1如果分泌表達(dá)，在無(wú)緩沖的MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測(cè)蛋白是否對(duì)中性PH蛋白酶敏感。另外，在緩沖培養(yǎng)基中加入1%酪蛋白氨基酸，抑制胞內(nèi)蛋白酶

2用SMD1168(蛋白酶A缺陷)進(jìn)行表達(dá)

3分泌表達(dá)水平低：檢測(cè)細(xì)胞沉淀，看是否總體表達(dá)水平低或蛋白沒(méi)有分泌 。如果不分泌，嘗試不同的信號(hào)序列(自身或α-factor信號(hào)序列)

4用硫酸銨沉淀或超濾濃縮上清(P52)

5Mut+，用高濃度培養(yǎng)物進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)

表達(dá)水平低：

1檢測(cè)Mut+及Muts重組子以期增加表達(dá)，一些蛋白在一種遺傳背景下表達(dá)比另一種好

2如果是分泌表達(dá)，嘗試胞內(nèi)表達(dá)，因?yàn)榈鞍撞荒苷_加工或不能分泌，檢查細(xì)胞沉淀是否有表達(dá)。如果胞內(nèi)表達(dá)有困難，嘗試進(jìn)行分泌表達(dá)。可能的糖基化也許是你需要的也許是不要的，如果不要，寡糖苷可用peptide: N-Glycosida F進(jìn)行去除。(P54)

3進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵(P52)，畢赤酵母是酵母，當(dāng)然更適于發(fā)酵。致電Invitrogen技術(shù)服務(wù)部尋求幫助。

沒(méi)有表達(dá)：

1先按前面所列簡(jiǎn)單方法進(jìn)行優(yōu)化，因?yàn)闆](méi)有表達(dá)與表達(dá)量極低情況相似。如果這些方法仍不能增加蛋白表達(dá)，進(jìn)行northern blot分析或檢查基因轉(zhuǎn)錄情況。附錄中有畢赤酵母RNA分離方法(P76)

2 PCR分析插入情況(P70)。PCR選取12-20個(gè)轉(zhuǎn)化子才可信，記得用空載體及單拷貝插入載體作對(duì)照分析PCR結(jié)果

3如果有轉(zhuǎn)錄提前終止，檢測(cè)基因的AT結(jié)構(gòu)，在釀酒酵母中，只有很少序列會(huì)使轉(zhuǎn)錄提前終止,其中之一TTTTTATA，與HIVI-gp120中ATTATTTTATAAA序列相似，在酵母中表達(dá)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)提前終止。改變?cè)撔蛄校拍艹霈F(xiàn)更長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄。

過(guò)糖基化：如果是過(guò)糖基化的

1試用胞內(nèi)表達(dá)，因?yàn)榈鞍撞唤?jīng)過(guò)分泌通路，不會(huì)被修飾

2用peptide: N-Glycosida F或其它酶進(jìn)行去糖基化

3去除基因N端糖基化位點(diǎn)

制作者：陳苗 商漢橋

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大規(guī)模表達(dá)：

表達(dá)指導(dǎo)：表達(dá)優(yōu)化后，可用更大搖瓶或用發(fā)酵罐來(lái)生產(chǎn)更多蛋白(P79)。用下列指導(dǎo)來(lái)進(jìn)行規(guī)模化表達(dá)，純化蛋白見(jiàn)參考(P53)

Mut+胞內(nèi)或分泌表達(dá)：

1挑取單克隆，接種至含25mlMGY，BMG或BMGY的250ml搖瓶中，28-30度，250-300rpm培養(yǎng)至OD600=2-6(約16-18小時(shí))

2將25ml培養(yǎng)基接種至含1LMGY，BMG或BMGY的3-4L搖瓶中，28-30度劇烈振蕩(250-300rpm)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=2-6)

3用滅菌離心管，室溫1500-3000g離心5min收集細(xì)胞。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，去除上清，用MM，BMM或BMMY重懸細(xì)胞至OD600=1.0(2-6L)進(jìn)行誘導(dǎo)

4分裝培養(yǎng)基至幾個(gè)3-4L隔板搖瓶，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住，放入搖床28-30度繼續(xù)培養(yǎng)

5每24小時(shí)，加甲醇至0.5%濃度，直至到達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間

6室溫，1500-3000g離心5min收集細(xì)胞。胞內(nèi)表達(dá)去除上清，細(xì)胞立即進(jìn)行處理或存于-80度。分泌表達(dá)，保留上清，置于4度預(yù)冷，如需要可進(jìn)行濃縮。接下來(lái)進(jìn)行蛋白純化或?qū)⑸锨宕嬗?80度備用。

Muts胞內(nèi)或分泌表達(dá)：

1挑取單克隆，接種至含10mlMGY，BMG或BMGY的100ml隔板搖瓶中，28-30度，250-300rpm培養(yǎng)至OD600=2-6(約16-18小時(shí))

2將10ml培養(yǎng)基接種至含1LMGY，BMG或BMGY的3-4L搖瓶中，28-30度劇烈振蕩(250-300rpm)，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=2-6)

3用滅菌離心管，室溫1500-3000g離心5min收集細(xì)胞。誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)，去除上清，將細(xì)胞重懸于1/5-1/10原體積的MM，BMM或BMMY培養(yǎng)基中(100-200ml)

4將培養(yǎng)基加至1L隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住，放入搖床28-30度繼續(xù)培養(yǎng)

5每24小時(shí)，加甲醇至0.5%濃度，直至到達(dá)最佳誘導(dǎo)時(shí)間

6室溫，1500-3000g離心5min收集細(xì)胞。胞內(nèi)表達(dá)去除上清，細(xì)胞立即進(jìn)行處理或存于-80度。分泌表達(dá)，保留上清，置于4度預(yù)冷，如需要可進(jìn)行濃縮。接下來(lái)進(jìn)行蛋白純化或?qū)⑸锨宕嬗?80度備用。

建議：為增加Muts重組子的數(shù)量，增加搖瓶數(shù)量，將200-300ml培養(yǎng)基加至3L搖瓶中或發(fā)酵培養(yǎng)。

濃縮蛋白：分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的蛋白，同質(zhì)性>50%，需要另外進(jìn)行純化，如果蛋白表達(dá)水平并不太高，可優(yōu)化濃縮蛋白。有幾種方法濃縮畢赤酵母分泌蛋白

*硫酸銨沉淀法 *透析 *體積小時(shí)，離心集中器 *體積大時(shí)，加壓濃縮 *凍干濃縮

細(xì)胞裂解：用玻璃珠進(jìn)行裂解

發(fā)酵：Invitrogen有發(fā)酵指導(dǎo)，建議曾做過(guò)或身邊有人曾做過(guò)發(fā)酵時(shí)再?lài)L試發(fā)酵。

蛋白純化與糖基化：

介紹：你已經(jīng)優(yōu)化蛋白表達(dá)程序，也通過(guò)大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)大量蛋白以進(jìn)行純化。你也許有蛋白純化的方法，由于每種蛋白都不同，很難推薦統(tǒng)一的技術(shù)用于純化

一些蛋白純化技術(shù)：確保細(xì)胞裂解及純化蛋白都在4度進(jìn)行

*離子交換色譜 *凝膠過(guò)濾 *親和色譜分析 *聚焦色譜 *等電聚焦免疫沉淀

制作者：陳苗 商漢橋

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*可溶性（膜蛋白）Lectin親和色譜

細(xì)胞裂解程序：準(zhǔn)備breaking buffer（BB）見(jiàn)附錄P60

1用BB重懸清洗細(xì)胞，4度下3000g離心5-10min，

2用BB重懸細(xì)胞至OD600＝50-100

3加入等體積的酸洗玻璃珠（0.5mm），通過(guò)替代預(yù)測(cè)體積

4渦旋混合物30s，冰上孵育30s，重復(fù)7次，間隔渦旋并預(yù)冷細(xì)胞抽提物減少蛋白變性

5在4度，12000g離心5-10min

6將上清轉(zhuǎn)至干凈容器并分析，總蛋白含量應(yīng)在5-10mg/ml

7保留細(xì)胞沉淀，用6M尿素或1%Triton X-100抽提來(lái)檢測(cè)不可溶蛋白

糖基化分析：在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)純化糖基化蛋白，需要盡快確定是否正確糖基化，最近發(fā)表的一些蛋白碳水結(jié)構(gòu)分析方法，使得分子生物學(xué)家可對(duì)糖基化目的蛋白進(jìn)行分析。

畢赤酵母培養(yǎng)基配方：

貯存液：

*10×YNB （13.4%酵母氮源堿（YNB）含硫酸銨不含氨基酸）

溶解134gYNB于1000ml水中，過(guò)濾除菌，加熱至YNB完全溶解，存于4度。或者用34gYNB（不含硫酸銨不含氨基酸），100g 硫酸銨進(jìn)行配制，可放1年。注意畢赤酵母在高濃度YNB下生長(zhǎng)更好。該試劑盒中所用YNB的量是釀酒酵母中的兩倍。

*500×生物素（0.02%）

溶解20mg生物素于100ml水中，過(guò)濾除菌，放于4度，可放1年

*100×H（0.4%組氨酸）

溶解400mg L-組氨酸于100ml水中，低于50度加熱以促溶解，過(guò)濾除菌，可放1年

*10×D（20%葡萄糖）

溶解200g D-葡萄糖于1000ml水中，高壓滅菌15min或過(guò)濾除菌，可放1年

*10×M（5%甲醇）

混合5ml甲醇與95ml水，過(guò)濾除菌存于4度，可放2個(gè)月

*10×GY（10%甘油）

混合100ml甘油與900ml水，過(guò)濾或高壓滅菌，室溫放置，可存放1年以上

*100×AA（0.5%各種氨基酸）

溶解各50mgL-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-賴(lài)氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸于100ml水中，過(guò)濾除菌，存于4度，可放1年

*1M磷酸鉀緩沖液 PH6.0

132ml 1M K2HPO4，868ml 1M KH2PO4，調(diào)整PH值為6.0±0.1（如果需調(diào)PH值，用磷酸或KOH）。過(guò)濾或高壓滅菌，室溫下可放1年以上

*YPD或YPED：Yeast Extract Peptone Dextro Medium(1L)

1%Yeast Extract 2% Peptone 2%Dextro (gluco)

1溶解10gYE, 20gPEP于900ml水中，如制平板加入20g瓊脂粉

2高壓20min

3加入100ml 10×D

*YPD-遺傳霉素平板：

1%酵母浸出物， 2%蛋白胨 2%葡萄糖 2% 不同量的遺傳霉素

100mg/ml遺傳霉素：用無(wú)菌水制備30ml 100mg/ml遺傳霉素貯存液，過(guò)濾除菌，存于-20度。用來(lái)制備含不同終濃度遺傳霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0

250ml（8－10個(gè)遺傳霉素平板）

制作者：陳苗 商漢橋

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1溶解2.5g酵母浸出物,5g蛋白胨,5g瓊脂粉于225ml去離子水中

2高壓滅菌20min

3加入25ml 10×D，混勻

4待YPD冷至55-60度，加入合適量遺傳霉素貯存液，同時(shí)也制幾個(gè)不含遺傳霉素的YPD平板

5混勻，不要產(chǎn)生太多氣泡

6傾倒10cm彼得里培養(yǎng)皿，凝固后，倒置存于4度，可放至少6個(gè)月

終濃度

0.25 0.5 0.75 1.0 1.5 1.75 2.0 3.0 4.0

ml遺傳霉素貯存液/250mlYPD

0.625 1.25 1.875 2.5 3.75 4.375 5.0 7.5 10

*MGY及MGYH （minimal glycerol medium±histidine）1L

1.34%YNB 1%甘油 4×10-5%生物素 ±0.004%組氨酸

1在800ml水中加入100ml 10×YNB,，2ml 500×B，100ml 10×GY

2培養(yǎng)his4菌株，需加入組氨酸（稱(chēng)為MGYH），加入10ml 100×H貯存液。

3存于4度，可放2個(gè)月

*RD及RDH液體培養(yǎng)基：regeneration dextro medium±histidine 1L

1M山梨醇 2%葡萄糖 1.34%YNB 4×10-5%生物素 0.005%氨基酸 ±0.004%組氨酸

1溶解186g山梨醇于700ml水中

2滅菌20min

3放冷并置于45度水浴

4準(zhǔn)備預(yù)溫（45度）的混合液

100ml 10×D

100ml 10×YNB

2ml 500×B

10ml 100×AA

88ml 滅菌水

加至山梨醇溶液中

5培養(yǎng)his4菌株，需加入組氨酸，在4中45度預(yù)溫混合液在加入10ml 100×H。4度保存，可放幾個(gè)月

*RDB或RDHB瓊脂平板：

1溶解186g山梨醇于700ml水中，加入20g瓊脂粉

2滅菌20min

3將溶液置于60度水浴，以防止溶液變稠

4準(zhǔn)備RD及RDH中用到的預(yù)熱的（45度）混合物，加至山梨醇/瓊脂粉溶液中。如選擇HIS＋轉(zhuǎn)化子，不要加組氨酸。

5制備平板，放于4度，可放幾個(gè)月。

*RD及RDH上層瓊脂：

1溶解186g山梨醇于700ml水中，加入10g瓊脂或瓊脂糖

2滅菌20min

3置于60度水浴

4準(zhǔn)備RD及RDH中用到的預(yù)熱的（45度）混合物，加至山梨醇/瓊脂粉溶液中，如選擇HIS＋轉(zhuǎn)化子，不要加組氨酸。

5如立即作轉(zhuǎn)化，將溶液置于45度

6存于4度，可放幾個(gè)月

制作者：陳苗 商漢橋

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*MD，MDH (minimal dextro medium±histidine) 1L

1.34% YNB 4×10-5%生物素 2%葡萄糖

1滅菌800ml水

2于60度下加入100ml 10×YNB，2ml 500×B, 100ml 10×D

3制MDH時(shí)，加入10ml 100×H,混勻存于4度

4如制備平板，于第一步加入15g瓊脂粉

5倒置平板，4度放置幾個(gè)月

*MM、MMH minimal methanol ±histidine 1L

13.4%YNB 4×10-5%生物素 0.5%甲醇

1滅菌800ml水

2于60度 下加入100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×M

3制MMH時(shí)，加入10ml 100×H,混勻存于4度

4如制備平板，于第一步加入15g瓊脂粉

5倒置平板，4度放置幾個(gè)月

*BMG、BMM Buffered minimal glycerol (methanol) 1L

100mM 磷酸鉀 PH6.0 1.34%YNB 4×10-5%生物素 1%甘油或0.5%甲醇

1滅菌700ml水，

2冷至室溫，加入下列：100ml 1M磷酸鉀緩沖液PH6.0, 100ml 10×YNB, 2ml 500×B, 100ml 10×GY

3制BMM時(shí),加入100ml 10×M取代10×GY

4放置于4度，可放2個(gè)月

*BMGY Buffered Glycerol-complex Medium

BMMY Buffered Methanol-complex Medium 1L

1%酵母浸出物 2%蛋白胨 100mM磷酸鉀 PH6.0， 1.34%YNB 4×10-5%生物素1%甘油或0.5%甲醇

1溶解10g酵母浸出物，20g蛋白胨于700ml水中

2滅菌20min

3冷至室溫，加入下列混合液：

100ml 1M 磷酸鉀緩沖液 PH6.0

100ml 10×YNB

2ml 500×B

100ml 10×GY

4制BMMY時(shí)，加入100ml 10×M取代10×GY

5存于4度，可放2個(gè)月

裂解緩沖液：

50mM 磷酸鈉 PH7.4

1mM PMSF(或其它蛋白酶抑制劑)

1mM EDTA

5%甘油

1準(zhǔn)備所需蛋白酶抑制劑貯存液，正確保存

2取900ml去離子水，6g磷酸鈉（單堿），372mg EDTA，50ml 甘油

3用NaOH調(diào)節(jié)PH，定容至1L，存于4度

4使用前，加入蛋白酶抑制劑

制作者：陳苗 商漢橋

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畢赤酵母重組及整合

介紹：通過(guò)轉(zhuǎn)化DNA與畢赤酵母基因組中同源序列的同源重組，畢赤酵母與釀酒酵母一樣可產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子。這些整合在無(wú)選擇壓力條件下，即使是以多拷貝出現(xiàn)，也表現(xiàn)出極度穩(wěn)定性。常用的表達(dá)載體含有選擇用HIS4基因，這些載體用限制酶線性化后，可在AOX1或his4位點(diǎn)進(jìn)行重組，從而產(chǎn)生HIS＋重組子。注意單十字交換事件（插入）比雙十字交換事件（替換）更容易發(fā)生，多拷貝插入事件自發(fā)發(fā)生率只有單插入事件的1-10%。

基因插入AOX1或aox1::AGR4位點(diǎn)：GS115的AOX1或KM71的aox1::AGR4位點(diǎn)與載體上三個(gè)AOX1區(qū)：AOX1啟動(dòng)子，AOX1轉(zhuǎn)錄終止子（TT）或AOX1下游遠(yuǎn)側(cè)序列（3‘AOX1）中的任一個(gè)之間發(fā)生單十字交換事件都會(huì)形成基因插入。結(jié)果在AOX1或aox1::AGR4基因的上游或下游插入一個(gè)或多個(gè)載體。轉(zhuǎn)化子在GS115中為HIS+ Mut+表型，在KM71中為HIS+ Muts表型。在重組質(zhì)粒5’或3‘AOX1區(qū)用限制酶進(jìn)行線性化，依轉(zhuǎn)化宿主菌的不同，可方便地產(chǎn)生Mut+或Muts重組子。

下圖顯示質(zhì)粒3‘端插入完整的AOX1位點(diǎn)（Muts），增加pAOX1、目的基因、HIS4（表達(dá)盒）。這也可發(fā)生在載體及基因組的5 AOX1區(qū)，在5‘AOX1位點(diǎn)產(chǎn)生5‘方向插入。盡管發(fā)生頻率很低，該事件也可發(fā)生在未線性化載體或自連的載體上。

基因插入His4位點(diǎn):GS115（Mut+）或KM71（Muts）中，染色體上his4位點(diǎn)與載體上HIS4基因之間發(fā)生單十字交換事件后會(huì)在his4位點(diǎn)形成插入。結(jié)果在his4位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)載體。由于基因組上AOX1或aox1::AGR4位點(diǎn)未發(fā)生重組，這些His＋轉(zhuǎn)化子的表型均與親本菌株相同。通過(guò)HIS4基因處限制性?xún)?nèi)切酶線性化，依轉(zhuǎn)化宿主菌不同，可方便地產(chǎn)生Mut+或Muts重組子。

下圖顯示質(zhì)粒插入雙拷貝HIS4/his4基因。一個(gè)為突變子，另一個(gè)為野生型。

制作者：陳苗 商漢橋

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基因多拷貝插入事件：細(xì)胞中單位點(diǎn)多基因插入確實(shí)可自發(fā)形成，雖然比例低，占所有HIS＋轉(zhuǎn)化子的1-10%，但卻是可測(cè)的。多拷貝插入事件的發(fā)生是因?yàn)榛蚩稍贏OX1、

aox1::AGR4位點(diǎn)或his4位點(diǎn)進(jìn)行插入。結(jié)果在GS115中產(chǎn)生Mut+ 表型，在KM71中產(chǎn)生Muts表型。定量dot blot及southern blot分析，差顯雜交均可檢測(cè)到多基因插入事件。（P74篩選多拷貝插入）

GS115中基因在AOX1處發(fā)生替代：在his4菌株如GS115中，載體及基因組中AOX1啟動(dòng)子及3‘ AOX1區(qū)的雙十字交換事件，可產(chǎn)生基因替代（omega插入）。結(jié)果AOX1編碼區(qū)全部被取代，產(chǎn)生HIS＋Muts表型。以AOX1位點(diǎn)由于基因替代而產(chǎn)生的Muts表型作為指示，可很容易地篩選HIS＋轉(zhuǎn)化子的Mut表型。基因取代的結(jié)果是缺失了AOX1位點(diǎn)（Muts），增加了含pAOX1、目的基因、HIS4的表達(dá)盒。下圖顯示AOX1位點(diǎn)的基因取代。

制作者：陳苗 商漢橋

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基因取代（雙交換事件）不如插入（單交換事件）發(fā)生得多，一般我們建議線性化質(zhì)粒通過(guò)單交換事件產(chǎn)生畢赤酵母重組子。用GS115或KM71菌株時(shí)，Mut表型與親本菌相同。

畢赤酵母電轉(zhuǎn)化：

介紹：該方法無(wú)需產(chǎn)生去壁細(xì)胞，是產(chǎn)生畢赤酵母重組子的簡(jiǎn)便方法。與去壁細(xì)胞效率相似。

細(xì)胞準(zhǔn)備：

1在含5mlYPD的50ml離心管中，培養(yǎng)畢赤酵母，30度過(guò)夜

2取0.1-0.5ml過(guò)夜培養(yǎng)物，接種含500ml新鮮培養(yǎng)基的2L搖瓶，過(guò)夜生長(zhǎng)至OD600＝1.3-1.5

3在4度，1500g離心5min收集細(xì)胞,用500ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞

4如上離心，用250 ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞

5如上離心，用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞

6如上離心，用1 ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約1.5ml

注意：可凍存80ul等量的電感受態(tài)細(xì)胞，但轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降很多

轉(zhuǎn)化：

1取80ul上述細(xì)胞與5-20ug線性化DNA（溶于5-10ulTE）混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中。

2在冰上放置5min

3根據(jù)所使用裝置推薦的釀酒酵母參數(shù)進(jìn)行電擊

4立即加入1ml預(yù)冷的1M山梨醇至杯中，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中

5分成200-600ul等份，涂于MD或RDB平板上

6在30度孵育平板至克隆產(chǎn)生，按P41篩選Mut+/Muts表型

PEG1000轉(zhuǎn)化方法：

介紹：據(jù)稱(chēng)PEG比LiCl方法好，但不如去壁細(xì)胞及電轉(zhuǎn)化法，但對(duì)沒(méi)有電轉(zhuǎn)裝置的人來(lái)說(shuō)，更方便，效率為102-103/ugDNA。

溶液準(zhǔn)備：

Buffer A: 1M山梨醇， 10mM bicine（N－二（羥乙基）甘氨酸）pH8.35，3%（v/v）乙二醇

Buffer B: 40%(w/v)聚乙二醇1000， 0.2M N－二（羥乙基）甘氨酸 pH8.35

Buffer C: 0.15M NaCl, 10mM N－二（羥乙基）甘氨酸 pH8.35

過(guò)濾除菌，存于-20度

新鮮的試劑級(jí)DMSO，未打開(kāi)或剛配制，存于-70度直至使用。

注意，當(dāng)細(xì)胞溶解后，即使放在冰上，其感受性下降都極快，加入DNA于冰凍的管中制作者：陳苗 商漢橋

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很關(guān)鍵。可進(jìn)行多個(gè)轉(zhuǎn)化，建議每次轉(zhuǎn)化6個(gè)。

感受態(tài)細(xì)胞制備：

1在YPD平板上劃線培養(yǎng)畢赤酵母菌，30度孵育2天

2從平板上挑取單克隆于10mlYPD中，30度振蕩過(guò)夜

3早上，在100mlYPD培養(yǎng)基中接種等量的過(guò)夜培養(yǎng)物，至OD600達(dá)0.1，在30度生長(zhǎng)至OD600為0.5-0.8

4室溫3000g離心收集細(xì)胞，用50ml Buffer A洗滌細(xì)胞1次

5用4ml Buffer A重懸細(xì)胞，分成0.2ml等份分裝至1.5ml離心管中，加入11ulDMSO于各管中，混合，并在液氮中快速冷凍細(xì)胞

6存于-70度

轉(zhuǎn)化：在<20ul水中加入50ug DNA,將DNA直接加入仍處于冰凍狀態(tài)的感受態(tài)細(xì)胞管中。載體DNA（40ug變性及超聲處理的鮭魚(yú)精DNA）中加入＜1ug DNA樣品，檢測(cè)最大轉(zhuǎn)化效率。

2在37度水浴中孵育各管5min，其間混勻1-2次

3取出各管，加入1.5ml Buffer B，完全混勻

4在30度水浴中孵育1小時(shí)

5室溫，2000g 離心樣品10min，去除上清，用1.5ml Buffer C重懸細(xì)胞

6再次離心，用0.2ml Buffer C重懸細(xì)胞

7將管中內(nèi)容物全部涂在選擇生長(zhǎng)平板上，30度孵育3-4天，篩選Mut表型（P41），或篩選遺傳霉素高抗性克隆（P37）

LiCl轉(zhuǎn)化方法：

介紹：該程序是依釀酒酵母修改的版本，是電轉(zhuǎn)化的替代方法。轉(zhuǎn)化效率為102-103cfu/ug線性化DNA。

溶液準(zhǔn)備：不能用醋酸鋰，一定要用氯化鋰

*用無(wú)菌去離子蒸餾水配制1M LiCl，過(guò)濾除菌，用無(wú)菌水稀釋

*用無(wú)菌去離子蒸餾水配制50%PEG（3350），過(guò)濾除菌，存于蓋緊的瓶中

*用TE（10mM Tris-HCl pH8.0 , 1.0mM EDTA）溶解2mg/ml變性斷裂鮭魚(yú)精DNA，存于-20度

細(xì)胞準(zhǔn)備：

1在50mlYPD中培養(yǎng)畢赤酵母至OD600＝0.8-1.0（約108個(gè)/ml）

2收集細(xì)胞，用25ml滅菌水洗滌，室溫1500g離心10min

3去除水，用1ml 100mM LiCl 重懸細(xì)胞

4將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中

5最大轉(zhuǎn)速沉淀細(xì)胞15s,用吸頭吸去LiCl

6在400ul 100mM LiCl中懸浮細(xì)胞

7將50ul細(xì)胞懸浮液移到1.5ml離心管中，每次用一管，現(xiàn)做現(xiàn)用，不要置于冰上或-20度保存

轉(zhuǎn)化：

1煮沸單鏈DNA 5min，快速放于冰水中使變冷，后置于冰上。注意：載體DNA不需要在每次用之前都煮，在-20度保存等份少量樣品，每次解凍一管，用3-4次后再煮。

2取上面第7步中細(xì)胞，離心去除LiCl

3每個(gè)轉(zhuǎn)化樣品，按順序加入下列試劑，PEG可保護(hù)細(xì)胞免受高濃度LiCl的有害作用

240ul 50%PEG， 36ul 1M LiCl， 25ul 2mg/ml 單鏈DNA， 溶解于50ul滅菌水中的制作者：陳苗 商漢橋

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質(zhì)粒DNA（5-10ug）

4劇烈渦旋細(xì)胞沉淀至完全混勻（1min）

5在30度孵育30min（不要搖動(dòng)）

6在42度水浴熱擊20-25min

7 6000-8000rpm離心，將轉(zhuǎn)化溶液轉(zhuǎn)移走

8用1ml滅菌水重懸細(xì)胞沉淀

9在RDB或MD平板上涂25-100ul,在30度孵育2-4天，篩選轉(zhuǎn)化子Mut表型及遺傳霉素高抗性克隆

PCR分析畢赤酵母整合：

介紹：下列程序可分析目的基因是否整合到基因組中，從6-10個(gè)Muts或Mut+畢赤酵母克隆中分離基因組DNA（P73），從轉(zhuǎn)化親本質(zhì)粒的菌株中提取DNA，進(jìn)行整合分析。用α-factor引物（僅用于pPIC9K）或5‘AOX1引物與3‘AOX1引物配對(duì)擴(kuò)增目的基因。該程序可證實(shí)基因插入，但不能證實(shí)插入位點(diǎn)。

更直接的PCR篩選方法見(jiàn)P72

PCR分析：設(shè)置PCR反應(yīng)如下：

10×PCR buffer 5ul

基因組DNA（1ug） 5ul

100mM dNTPs(25mM/個(gè)) 1ul

5‘AOX1引物(0.1ug/ul) 5ul

3‘AOX1引物(0.1ug/ul) 5ul

加入滅菌水至 50ul

Taq多聚酶（5U/ul） 0.25ul

用20ul滅菌水重懸引物，制成0.1ug/ul溶液，如需要可減少引物量。如20pmol引物，加2ul引物進(jìn)行擴(kuò)增。

對(duì)照： 100ng重組質(zhì)粒（陽(yáng)性對(duì)照），100ng不含插入基因的相同質(zhì)粒（陰性對(duì)照）

2加入50ul礦物油，如果PCR儀有防蒸發(fā)系統(tǒng)，不需要加礦物油。

3上樣，按下列程序：

步驟

熱啟動(dòng)

變性

退火

延伸

最終延伸

溫度

94度

94度

55度

72度

72度

時(shí)間 min

2

1

1

1

7 1

循環(huán)

1

25-35

4用0.8%瓊脂凝膠分析10ul樣品，緩沖液為1×TAE

5如果篩選Mut+整合，可見(jiàn)兩條帶，一條與目的基因相關(guān)，另一條為AOX1基因（大約2.2kb），如果篩選GS115中Muts整合，可見(jiàn)與目的基因相關(guān)的一條帶。在KM71中，由于ARG4插入AOX1，PCR產(chǎn)物為3.6kb。親代質(zhì)粒產(chǎn)生下列大小PCR產(chǎn)物。在分析PCR結(jié)果時(shí)，需將這些片段的長(zhǎng)度加到最終片段中。

載體

pPIC3.5k

pAO815

pPIC9k(用5‘AOX1引物)

pPIC9k(用α-factor引物)

PCR產(chǎn)物

220bp

189bp

492bp

195bp

制作者：陳苗 商漢橋

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重要：如使用α-factor引物，在GS115及KM71中都可見(jiàn)一條帶。因?yàn)槿旧wAOX1基因上沒(méi)有α-factor信號(hào)序列。

注意：有時(shí)PCR會(huì)產(chǎn)生假帶，這不重要因?yàn)樗鼈儾⒉划a(chǎn)生什么問(wèn)題。

PCR分析示例：下面是PCR分析的典型例子，從畢赤酵母重組菌、合適的對(duì)照中分離基因組DNA，在0.8%瓊脂糖凝膠上，每個(gè)PCR樣品點(diǎn)10ul。

泳道1含有1kb及100bp條帶。

泳道2顯示野生型AOX1基因2.2kb及含目的基因的2.4kb產(chǎn)物

（GOI, 1.9kb）及GS115/ pPIC9k/ GOI中492bp的AOX1基因側(cè)

翼序列 。

泳道3顯示GS115中野生型AOX1基因。

注意：Invitrogen“Easy-DNA”試劑盒可快速簡(jiǎn)便地分離

畢赤酵母基因組DNA。

畢赤酵母克隆直接進(jìn)行PCR篩選：

介紹：有報(bào)道稱(chēng)可用PCR直接檢測(cè)畢赤酵母克隆中的插入基因，簡(jiǎn)單講，通過(guò)酶、冷凍及熱處理相結(jié)合的方法裂解細(xì)胞，基因組DNA可直接用作PCR模板。

開(kāi)始前：準(zhǔn)備下列試劑及儀器

＊畢赤酵母轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基或單克隆 ＊1.5ml離心管 ＊5U/ul溶細(xì)胞酶溶液（Lytica）＊30度水浴，或熱擊 ＊液氮 ＊PCR試劑

程序：

1在1.5ml離心管中加入10ul畢赤酵母培養(yǎng)物，若培養(yǎng)物很濃，可將1ul培養(yǎng)物稀釋至9ul水中，或直接挑取單克隆，重懸于10ul水中。

2加入5ul 5U/ul的溶細(xì)胞酶lityca, 30度孵育10min

3將樣品凍存于-80度10min，或浸入液氮中1min

4設(shè)立50ul PCR反應(yīng)體系

10×反應(yīng)buffer 5ul

25mM MgCl2 5ul

25mM dNTPs 1ul

5‘AOX1引物(0.1ug/ul) 1ul

3‘AOX1引物(0.1ug/ul) 1ul

滅菌水 27 ul

細(xì)胞裂解液 5 ul

總體積 45ul

5混合溶液，覆蓋20ul礦物油

6將溶液置于熱循環(huán)器中，95度孵育5min

7加入5ul 0.16U/ul Taq聚合酶（0.8U）

8按下列參數(shù)循環(huán)30次

步驟

變性

退火

延伸

最后延伸

溫度

95度

54度

72度

72度

時(shí)間min

1

1

1

7

9在瓊脂糖凝膠中分析10ul等量樣品

制作者：陳苗 商漢橋

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畢赤酵母總DNA提取

介紹：下列操作可從所需的HIS＋重組子及未轉(zhuǎn)化的GS115、KM71中提取DNA，適用于southern 分析，dot /slot blot分析 或基因組PCR

溶液：需要配制下列溶液，有些試劑在試劑盒中沒(méi)有

最小培養(yǎng)基 (MD，MGY) 滅菌水

SCED(1M 山梨醇，10mM檸檬酸鈉 pH7.5, 10mM EDTA, 10mM DTT)

藤黃節(jié)桿菌酶 3mg/ml 貯存液 1%SDS 5M醋酸鉀 pH8.9

TE buffer pH7.4 (10mM Tris-HCl pH7.4, 1mM EDTA pH8.0)

7.5M醋酸銨 pH7.5 酚：氯仿(1：1，V/V)

準(zhǔn)備：

1在30度，在10mlMD或MGY中培養(yǎng)重組子，在10mlMDH，MGYH中培養(yǎng)GS115或KM71至OD600=5-10

2室溫，1500g離心5-10min

3用10ml滅菌水洗滌細(xì)胞，如2中離心

細(xì)胞去壁及裂解：

1在2mlSCED緩沖液(pH7.5)中重懸細(xì)胞，溶液現(xiàn)配現(xiàn)用

2加入0.1-0.3ng藤黃節(jié)桿菌酶(加前混合均勻)，37度孵育50min，獲得去壁率<80%去壁細(xì)胞(監(jiān)測(cè)去壁細(xì)胞比例，P33-34)

3加入2ml 1%SDS，輕輕混勻，冰上放置5min(0-4度)

4加入1.5ml 5M醋酸鉀 pH8.9， 輕輕混勻

5在4度 1000g離心4min，保留上清

DNA沉淀：

1從上述5中轉(zhuǎn)移上清，加入2倍體積乙醇，室溫放置15min

2在4度 1000g離心20min

3用0.7mlTE pH7.4輕輕重懸沉淀，轉(zhuǎn)入離心管中

4以下操作需輕柔，用等量的酚：氯仿(1:1 v/v)抽提取,再用等量的氯仿：異戊醇(24:1)抽提。將上層水相轉(zhuǎn)入兩個(gè)離心管中。

5每管中加入1/2體積的7.5M醋酸銨，2倍體積的乙醇，干冰上放置10min，或-20度放置60min

6在4度 10000g離心20min,用1ml70%乙醇洗滌沉淀，空氣干燥沉淀。用50ulTE pH7.5重懸沉淀。測(cè)定DNA樣品濃度。兩管可分別存放或合在一起存放于-20度。

多拷貝重組子拷貝數(shù)：

介紹：你若想知道畢赤酵母重組子準(zhǔn)確插入數(shù)，可用定量blot或southern 雜交來(lái)分析拷貝數(shù)。需要分離轉(zhuǎn)化有親代載體、含單拷貝的pAO815或pPIC3.5k及含多拷貝外源基因的畢赤酵母重組子的基因組DNA。

定量dot blot溶液：需要下列溶液，每個(gè)反應(yīng)10-15ml，3MM紙, 50mM EDTA, 2.5% β-

巰基乙醇 pH 9.0, 1mg/ml藤黃節(jié)桿菌酶100T, 0.1N NaOH, 1.5M NaCl, 2×SSC

定量dot blot 程序：下列為DNA快速dot blot技術(shù)檢測(cè)多拷貝插入。在濾紙上點(diǎn)等量的細(xì)胞對(duì)定量拷貝數(shù)很重要。另外可提取基因組DNA，直接點(diǎn)在醋酸纖維膜或尼龍膜上，固定并分析。

1在30度，在96孔板上用200ul YPD分別培養(yǎng)Mut+及Muts轉(zhuǎn)化子直至到相同濃度，制作者：陳苗 商漢橋

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可能要傳幾代(p39)。另外可在培養(yǎng)管中培養(yǎng)單個(gè)轉(zhuǎn)化子，加入培養(yǎng)基至OD600吸收值一致。

2用多孔道移液器吸取50ul樣品至安裝于dot blot裝置上的醋酸纖維膜或尼龍膜上，自然干燥膜。

3裂解膜上細(xì)胞，用下列4種溶液進(jìn)行處理：在托盤(pán)中放置兩塊3MM紙，用10-15ml

50mM EDTA，2.5% β- 巰基乙醇 pH 9.0進(jìn)行浸泡。確保紙浸泡一致，不要有氣泡。將醋酸膜正面對(duì)著3MM紙，室溫孵育15min

4將醋酸膜從3MM紙上取走，更換另兩張3MM紙，用10-15ml 1mg/ml藤黃節(jié)桿菌酶100T 浸泡，將醋酸膜正面對(duì)著3MM紙，37度孵育4小時(shí)

5將膜移走，再換兩張3MM紙，用10-15ml 0.1N NaOH, 1.5M NaCl浸泡，將醋酸膜正面對(duì)著3MM紙，室溫孵育5min

6將膜移走，再換兩張3MM紙，用10-15ml 2×SSC浸泡，將醋酸膜正面對(duì)著3MM紙，室溫孵育5min,重復(fù)一次

7在80度烘干醋酸纖維膜，或用UV-crosslink烘干尼龍膜。膜可用與目的基因互補(bǔ)的非放射性標(biāo)記或32P標(biāo)記的隨機(jī)引物探針進(jìn)行反應(yīng)。多拷貝整合可通過(guò)與單拷貝對(duì)照相關(guān)的強(qiáng)烈雜交信號(hào)來(lái)進(jìn)行確定。Dot blot 可通過(guò)膜或blot 的密度計(jì)量，如用放射性標(biāo)記的用β-scanner來(lái)確定拷貝數(shù)。

Southern blot:用正確的內(nèi)切酶消化DNA非常重要，消化后凝膠分離基因組DNA可用于點(diǎn)膜。如果用pPIC3.5K或pAO815產(chǎn)生的多拷貝，那樣方法可能不一樣。消化含多拷貝目的基因的重組子DNA，會(huì)產(chǎn)生一條因插入數(shù)目不同而密度不同的帶。用單拷貝作對(duì)照看密度也非常重要，用密度計(jì)量計(jì)定量條帶的密度可預(yù)測(cè)基因的數(shù)量。

對(duì)照：用宿主菌(GS115，KM71)DNA，轉(zhuǎn)化親本載體菌DNA(pPIC3.5K或pAO815)，轉(zhuǎn)化含單拷貝基因載體的DNA作對(duì)照很重要。用HIS4基因探針作為單拷貝及基因的內(nèi)在對(duì)照。注意，如果基因插入his4位點(diǎn)，可產(chǎn)生兩拷貝HIS4基因，一個(gè)突變型，一個(gè)野生型。(見(jiàn)畢赤酵母重組及整合部分)

基本指導(dǎo)：

1用分子克隆中southern 標(biāo)準(zhǔn)溶液

2分離基因組DNA，用熒光計(jì)定量。確保去除RNA。確定拷貝數(shù)時(shí)，點(diǎn)相同量DNA很重要。

3要有southern 探針，HIS4基因探針及目的基因探針。注意：如果你的探針完全與野生型基因互補(bǔ)的話，宿主菌中his4基因的點(diǎn)突變并不影響雜交。

4如用pPIC3.5K產(chǎn)生多拷貝，用BglII消化DNA。注意：如用pPIC3.5K，并不是所有多插入子都是以頭-尾形式存在。有些可能是頭-頭、尾-尾形式。建議你們自己思考可能產(chǎn)生的產(chǎn)品。相反方向的表達(dá)盒會(huì)產(chǎn)生不同的帶，Southern blot時(shí)，當(dāng)拷貝數(shù)>2時(shí)，會(huì)產(chǎn)生1條或2條帶(根據(jù)方向)，這都會(huì)增加密度。

5如用pAO815產(chǎn)生多插入子，用BglII及BamHI消化基因組DNA，釋放多插入子，條帶的分子量可幫助確定插入數(shù)。如果多插入子很大，可用SacI進(jìn)行消化。這樣可產(chǎn)生包含單個(gè)目的基因的片段。這樣將會(huì)產(chǎn)生一條非常亮的帶。根據(jù)它與單拷貝基因所產(chǎn)生的帶的相對(duì)亮度，可判斷插入數(shù)。

6用BalII消化GS115基因組。轉(zhuǎn)化pPIC3.5K或pAO815的GS115基因組，用HIS4互補(bǔ)探針進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，可產(chǎn)生一條2.8kb的帶(基因組中HIS4基因)及一條約6.7kb(載體來(lái)源的HIS4基因)的帶。

制作者：陳苗 商漢橋

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