法醫學雜志 2010年 10月 第26卷 第5期 ?343?
InDel
typer30:用于中國5個主要民族DNA鑒定的多重
—
PCR系統
趙書民,張素華,李成濤
(司法部司法鑒定科學技術研究所上海市法醫學重點實驗室,上海200063)
摘 要:目的采用插入/缺失(Insertion/Deletion,InDe1)多態性遺傳標記,建立一種可用于中國漢族、回族、
維吾爾族、蒙古族、藏族5個主要民族法醫DNA鑒定的多重PCR系統。 方法采用人類基因組瀏覽器和
dbSNP數據庫篩選具有高度遺傳多態性的人類常染色體InDel標記.采用Primer 3軟件設計多重PCR引
物.通過復合熒光標記系統建立多重PCR擴增體系,采用該體系對漢、回、維、蒙、藏5個民族進行多態性調
查 結果成功建立了一個包含30個InDel位點和Amelogenin性別鑒定位點的復合熒光多重PCR擴增體
系.命名為InDel 多態性調查顯示這30個 el位點在上述5個主要民族中均呈高度遺傳多態性,
typer30 InD
.
平均期望雜合度分別為:0.464、0.460、0.453、0.466和0.469,平均個人識別率分別為:0.595、0.585、0.586、0.589
和0.595 該系統在5個民族中的累積個人識別率(CDP)均達到0.999999999996以上。結論InDel typer30
是一種適用于中國漢、回、維、蒙、藏5個主要民族的法醫DNA鑒定系統
關鍵詞:法醫遺傳學;聚合酶鏈反應;插入/缺失多態性;親權鑒定
中圖分類號:DF795.2 文獻標志碼:A doi:10.3969/j.issn.1004—5619.2010.05.007
文章編號:1004—5619(2010)05—0343—06
InDel
typer30:A Multiplex PCR System for DNA Identiicatifon among Five Chi-
—
nese Populations
ZHA 0 Shu—min,ZHANG Su-hu ̄LI Cheng-tao
(Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Institute of Forensic Science, n f,),of Justice,P.R.Chi—
na,Shanghai 200063,China)
Abstract:Objective To develop a multiplex PCR system,using inserti0n/deleti0n(InDe1)polymorphism mark—
ers,for forensic DNA identiication among Han,Hui,Uighur,Mongolian and Tifbetan populations in China.
Methods Highly polymorphic InDel markers from human autosomes were selected using the Human
Genome Browser in Galaxy system and dbSNP database.Multiplex PCR primer pairs of selected InDel
markers were designed using Primer 3 software. rhe multiplex PCR system was developed using a five
luorescence dye lfabeling system.Genetic polymorphisms of selected InDel markers were investigated using
the multiplex PCR system among five populations in China.Results A new multiplex genotyping system,
named InDel
typer30,was successfully developed and validated in this study.The InDel
typer30 system
——
_
consisted of 30 highly polymorphic InDel markers and 1 A melogenin gender marker.The average expected
heterozygosity of the 30 InDel markers was 0.464,0.460,0.453,0.466 and 0.469 for the Han,Hui,Uighur,
Mongolian and Tibetan populations,respectively.The average discrimination power was 0
595,0.585,0.586,
.
0.589 and 0.595 for the Han,Hui,Uighur,Mongolian and Tibetan populations,respectively.The cumulative
discrimination power(CDP)were all above 0.999 999 999 996 for the 5 populations.Conclusion In—
Del typer30 was a useful forensic DNA identiication toolf for human identiicatifon among Han
,
Hui,
Uighur,Mongolian and Tibetan populations in China.
Key words:forensic genetics;polymerase chain reaction;insertion/deletion polymorphism;parentage testing
插入/缺失(insertion/deletion,InDe1)多態性是指
基因組中插入或缺失不同大小的DNA片段所形成
基金項目:中央級科研院所社會公益研究資助項目(GY0902)
的多態性遺傳標記[”。2006年5月,Genome Research
雜志上發表了~個包含了人類基因組中400000多
個InDel標記的圖譜 .這一工作大大地促進了InDe1
在各領域的應用研究【3_。從法醫學應用的角度來看.
InDel標記作為一種特殊類型的二等位基因遺傳標
記,由于兼具單核酸多態性(single nucle0tide Dolv.
morphism,SNP)和短串聯重復序列fshort randem re.
作者簡介:趙書民(1973一),男,河南開封人,博士,主要從事
法醫遺傳學研究;E—mail:zhaoshuminxl@hotmail.com
通信作者:李成濤,男,副研究員,主要從事法醫遺傳學研究:
E—mail:liehengtaohla@163.con
?
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Journal of Forensic Medicine,October 2010,Vo1.26,No.5
peat,STR)的特征以及分型技術平臺的普適性強.從
而受到了國內外法醫學者的關注 近兩年來.已有
擴增子長度將InDe1位點分為4組,分別采用FAM、
HEX、TAMERA和ROX 4種熒光素標記.調整每一
多位學者建立了適用于本民族法醫學DNA鑒定的
InDel多重PCR體系 】 本課題組也曾對中國漢族人 多重PCR擴增體系為15.0 L,包括MasterMix 7.5 L,
群中部分InDel位點的多態性進行了研究 在前期
工作的基礎上,本研究采用復合擴增熒光檢測技術建
引物的濃度使之適合QIAGEN多重PCR擴增體系
Q-solution 1.5 L,PrimerMix 3.0 L,模板DNA 3.0 L。
多重PCR擴增條件為:95 qC 11 min:94℃30 S.57 cI=
90 S,72℃90s,共30個循環;60℃延伸60min 單位
點PCR擴增時按上述循環參數進行35個循環后.
立了一個可用于中國漢族、回族、維吾爾族、蒙古族、
藏族5個主要民族法醫DNA鑒定的多重PCR系統.
現報道如下
1材料與方法
1.1無關個體樣本
108例華東地區漢族無關個體、71例寧夏回族無
關個體、96例新疆維吾爾族無關個體、58例內蒙古蒙
古族無關個體和86例西藏藏族無關個體.其中蒙古
族和藏族DNA樣本為復旦大學現代人類學教育部重
點實驗室饋贈
1.2主要試劑與儀器
AmpliTaq GoldTM DNA聚合酶、POP4膠、去離子
甲酰胺、IOxTAE、人類標準品DNA(9947A,0.1 ng/ ̄tL)
均購自美國AB公司.多重PCR試劑盒購自QIAGEN
公司.熒光標記PCR引物由上海基康生物技術公司
合成.分子量內標S1Z350購自元錫中德美聯生物技
術公司 9700型PCR儀、3130遺傳分儀為美國AB
公司產品.FR一200A全自動紫外與可見分析儀為上
海復日科技有限公司產品
1.3 InDe1位點篩選
以美國加州大學圣克魯茲分校(University of
Calif0rnia Santa Cruz UCSC)人類基因組生物信息學
中心(UCSC Genome Bioinformatics Group)開發和
維護的銀河系統(Galaxy)中的人類基因組瀏覽器
Genome Browser) ̄sl為篩選工具.結合dbSNP數據庫[91,
按以下擬定標準進行InDel位點篩選:(1)InDel等位
基因長度(插入或缺失的堿基)≥3bp且<30bp;(2)位
于內含子區域;(3)dbSNP數據庫中該InDel位點的最
低等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)介于
O.2O 0.50:(4)散布于人類全部22條常染色體;(5)同
一
條染色體上的InDel位點間距不小于5 Mb;(6)同
一
條染色體上InDel位點不形成連鎖,且在中國漢族
人群中的分布符合Hardy—Weinberg遺傳平衡。
1.4復合熒光標記多重PCR擴增體系的建立
采用Primer 3軟件包 設計篩選獲得的InDel位
點及A.tel0genin基因座性別鑒定位點的多重PCR引
物.以9947A為模板采用所設計的引物進行單位點
PCR擴增.瓊脂糖凝膠電泳評估引物擴增效果。依據 為性別鑒定位點(該基因座在X染色體和Y染色體
72℃延伸10min
1.5復合熒光標記多重PCR擴增體系分析方法的
建立
復合熒光標記多重PCR擴增體系的毛細管電泳
結果采用美國AB公司GeneMapper v3.2軟件進行分
析。對所確定的InDel位點以9947A為模板采用熒光
標記引物進行單位點擴增后.通過毛細管電泳獲得各
位點不同等位基因的電泳遷移參數.以此參數為基礎
按GeneM印per v3.2軟件的格式要求編寫相應的Bin
文件和Panel文件,建立分析方法。該分析方法中等
位基因命名規則如下:lnDel位點中的插入(Inserti0n)
等位基因命名為1.缺失(Deletion)等位基因命名為
0 Amelogeni 基因座的兩個等位基因分別命名為x
和Y。
1.6多重PCR體系分型結果的驗證
對標準品DNA 9947A以普通PCR引物擴增后
遞交上海捷瑞生物技術有限公司進行克隆測序.以驗
證多重PCR分型結果的準確性 所建立的多重PCR
擴增體系包含本課題組前期完成的采用SNP1ex系統
完成的29個InDel位點中的一個作為質控位點同。
1.7統計分析
InDel位點等位基因頻率計算、Hardy—Weinberg
遺傳平衡檢驗、同一染色體上lnDel位點的連鎖不平
衡分析采用SNP Anal ̄rzer 2.0【“1。采用PowerStNs V12.
xls軟件包 計算各InDel位點的個人識別率(discrim.
ination Dower,DP)和期望雜合度(expected heterozy.
gositv,He)。其他民族與漢族InDel位點等位基因頻
率比較采用 檢驗和Fisher精確檢驗,統計軟件包
采用SAS v8.2。分子方差分析(analysis.of molecular
variance.AMOVA)采用GenA1Ex v6.3[131。檢驗水準
=
0.05
2結 果
2.1 InDel位點的篩選及多重PCR體系的建立
按1_3所擬定的InDel位點篩選條件共篩選得到
56個候選InDel位點.另增加Amelogenin基因座作
法醫學雜志 2010年 10月 第26卷 第5期
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上的擴增子相差6bp,其特性與InDel位點類似),共
57個位點.以9947A為模板進行單位點擴增的瓊脂
糖凝膠電泳效果見圖1。依據單位點擴增結果、不同
位點擴增子長度及隨后各位點在漢、回、維、蒙、藏 控位點嘲。圖2所示為9947A采用InDel—typer30系統
5個民族中的多態性確定了30個InDel位點和
Amelogenin基因座的性別鑒定位點組成一個多重
yper30。30個InDel位點的 t
PCR體系.命名為InDel
基本信息見表l,其中7號位點(rsl160953)為內部質
分型后以所建立的分析方法分析所獲得的分型圖譜。
17號為Amelogenin性別位點,其余為InDel位點;M:100bp梯度標準品
圖1候選位點普通PCR擴增2%瓊脂糖凝膠電泳圖
表1 InDel
_
typer30系統所包含的30個InDel位點的基本信息
注:1)rs#為相應InDel位點在dbSNP數據庫(版本號為131)中的登錄號(下同);2)Deletion在InDel typer30分型系統中命名為等
位基因0,Insertion命名為等位基因1;3)標示InDel位點在相應染色體上的物理位置
,
所采用的人類基因組數據庫的版本號為37
.
1
?
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i j ll 4
分型結果見表1 以9947A為模板.通過單位點擴增
克隆測序后結果顯示.InDel 系統分型結果與
typer30
!
苧~竺 竺竺 三
測序結果一致。中國漢族樣本中.內部質控位點
蘑 # .0毯 * 瓣| l }g /
—
rsl160953采用InDel typer30系統和SNPlex系統閹的
分型結果一致
2.3 InDel typer30中各InDel位點在不同民族中的
等位基因頻率及其分布差異
各InDel位點在5個民族中的等位基因頻率見
標記為T17的為Amelogenin基因座上的性別鑒定位點
表2。經xz檢驗共有14個InDel位點的等位基因頻
結果顯示9947A為來自女性樣本
率分布在5個民族中差異具統計學意義(尸<0.05).對
圖2標準品DNA 9947A采用InDel
_
typer30系統
于這14個InDel位點.采用Fisher精確檢驗比較其
的分型圖譜
他民族與漢族等位基因頻率的差異.等位基因頻率分
2.2 InDel
—
typer30分型結果的驗證
布與漢族差異有統計學意義的在表2中以粗體顯示
標準品DNA 9947A采用InDel(U<0.0125),其中第14號位點(rs34535242)在漢族與
—
typer30系統的
表2 30個InDel位點在5個不同民族中的等位基因頻率
漢族人群相比、該位點等位基因頻率經Fisher精確檢驗差異具有統計學意義(火0.0125,經Bonferroni校正)
法醫學雜志 2010年 10月 第26卷 第5期
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其他4個民族間頻率差異無統計學意義(P >0.0125)。
AMOVA分析結果顯示.30個InDel位點在5個民族
中的遺傳差異有96.00%來自于不同個體問,不同民
位點互不連鎖
2.5 InDel typer30中各InDel位點在不同民族中的
個人識別率和期望雜合度
InDel!yper30中各InDel位點在不同民族中的
DP、He和累積個人識別率(cumulative discrimination
power.CDP)見表3。
族所導致的遺傳差異僅占4.00% 在漢族與回族問未
發現等位基因頻率分布存在差異的InDel位點.而針
對這兩個民族樣本進行的AM0VA分析也顯示因民
族差異所造成的遺傳差異為0.00%.兩種不同分析方
法結果一致
3討論
2.4 InDel typer30中各InDel位點在漢族人群中的 STII是法醫DNA鑒定中最為常用的遺傳標記,
連鎖不平衡分析
常染色體STR復合熒光多重PCR分型技術已經成為
經Bonferroni校正.Hardy—Weinberg遺傳平衡檢
一
項國際法醫學界不可或缺的、公認的重要親權鑒定
驗結果顯示.InDe1 lyper30系統中的3O個InDel位
技術手段并已積累了成熟的經驗。然而STR的高突
點在漢、回、維、蒙、藏5個民族中均達到遺傳平衡。連
變率這一缺陷 5】促使法醫物證工作者致力于尋找更
鎖不平衡分析結果顯示.在同一條染色體上的InDel
為穩定的遺傳標記 InDel作為一種特殊的二態性遺
表3 InDeltyper30中各InDel位點在不同民族中的DP和He值
注:黑體所示為相應指標的最低值
?
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傳標記,與SNP具有相近的自然突變率.其突變率顯
著低于STR。同時,InDel的兩個等位基因表現為片段
長度多態性,這又與STR等位基因的特征類似.使其
可以采用目前法醫DNA鑒定領域常用的復合熒光多
重PCR聯合毛細胞電泳分型技術進行分型檢測.因
而成為法醫DNA鑒定關注的熱點 J
在本研究中.筆者通過全基因組瀏覽器這一有
效的人類基因組掃描工具.篩選獲得了30個散布
于16條常染色體上、互不連鎖的InD。l位點.并以
此為基礎聯合Amelogenin基因座上的性別鑒定位
點.采用復合熒光多重PCR技術建立了包含30個
InDel位點和1個性別位點的多重PCR體系一In. DNA鑒定中常用的商業STR分型試劑盒(如Sinofiler
De1 typer30,并建立了相應的GeneMapDer v3.2軟件
的分析方法.從而組合成了一套切實可行的法醫
DNA鑒定工具 實際應用表明InDel typer30系統的
分型是準確的。在中國漢、回、維、蒙、藏5個民族中
進行的遺傳多態性的調查也表明.這30個InDel
位點在上述5個民族中的平均He分別達到了
0.464、0.460、0.453、0.466和0.469,平均DP分別達到
了0.595、0.585、0.586、0.589和0.595,而CDP值分別
達到了0.999 999 999 998 41、0.999 999 999 996 90、
0.999 999 999 997 09、0.999 999 999 997 72和
0.999 999 999 998 54 這也表明InDel typer30系統
對于中國這5個主要民族.無論是進行親權鑒定或是
個體識別均是一個有效的工具 已有研究表明.在一
個達到遺傳平衡的理想群體中.對于二等位基因遺傳
標記如SNP、InDel等,當其MAF達到0.500時,其個
人識別率達到最高 3個這樣的位點其CDP可達到
0.947.這一CDP值相當于1個目前個人識別常用
STR基因座的DP值 因此.可以推測InDel typer30
系統的CDP值近似于12個常用STR基因座的
CDP 需要注意的是.在該系統中所有InDel位點的擴
增子長度均小于260bp,這雖然成為限制這一系統所
包含的InDel位點數的因素之一.但同時也成為這一
系統的一個優勢.使其具備了應用于降解DNA檢材
的潛能
表3結果顯示.與漢族人群相比,維、蒙、藏3個
民族在多個InDe1位點上等位基因頻率分布與漢族
存在差異.這種頻率差異顯示的是這3個民族與漢族
在遺傳結構上的差異 AMOVA分析也顯示研究樣本
中的f共419例樣本)遺傳變異僅有4.00%是由于民族
的不同所造成的.而主要的遺傳變異來源是個體的不
同所造成的.這也從另一個側面顯示了InDel
—
typer30
系統對5個民族的適用性 但事實上.某一位點在不
同民族中遺傳結構的差異雖然會影響其在這些民族
Journal of Forensic Medicine,October 2010,Vo1.26,No.5
中的法醫學應用,但并不絕對。以InDel typer30系統
中的6號位點rs1610949為例,在漢族人群中.該位
點Insertion(1)等位基因的頻率僅相當于藏族人群中
該位點Deletion(0)等位基因的頻率.均接近0.37.
Fisher分析也顯示該位點在漢、藏2個民族中的等位
基因頻率差異具統計學意義(P=8.47x10-7).但該位點
在兩個民族中的DP值相似(0.606 VS 0.616)
InDel
_
typer30系統的不足之處在于所包含的位
點數仍不夠多。采用諸如InDel這樣的二等位基因遺
傳標記進行法醫學DNA鑒定所面臨的共同難點之一
是,需要的位點數較多。如前所述,要達到與目前法醫
系統)同等個人識別率約需要60個這樣的位點 這
將顯著增加相應多重PCR擴增體系構建的難度 但
顯然,InDel
—
typer30系統的出現已為InDel標記在中
國人群中的應用奠定了一定的基礎
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(下轉第356頁)
?
356?
Journal of Forensic Medicine,October 2010,Vo1.26,No.5
行為的精神病人是無民事行為能力人.由他的法定代
驗中兩分半量表間具有較高的相關系數(r:0.942 9.
P=0.000);從量表各項目原始均分及其與總分的相關系
理人代理民事活動。不能完全辨認自己行為的精神病
人是限制民事行為能力人.可以進行與他的精神健康
狀況相適應的民事活動:其他民事活動由他的法定代
理人代理,或者征得他的法定代理人的同意” 然而民
事行為能力的評定尚無統一的客觀評定工具.完全靠
經驗判斷。這就難免因鑒定人的經驗不同而出現鑒定
結論不一致的現象 鑒于此.筆者著手制定民事行為
數來看,各條目與總分的Spearman相關系數在0.643~
0.882(P=O.000)。說明該量表具有良好的穩定性和可
操作性,即具有良好的信度
以限制民事行為能力均分加減一個標準差后所
得7、15分作為劃界分.即0-6分為完全民事行為能
力,7~15分為限制民事行為能力.16~28分為無民事
行為能力,根據劃界分將所有研究對象分為完全、限制
和無民事行為能力組,量表得分結論與專家意見的分
能力的評定量表.推進精神障礙者民事行為能力標準
化評定。在量表編制時,堅持民事行為能力三級評定.
即完全民事行為能力、限制民事行為能力和無民事行
為能力。按照一般量表的制作方式和方法.對前期的
研究成果繼續深化.主要是將民事行為能力的6項考
組結論一致性較高(,(=0.841,P=0.000)。采用判別分
析方法,涉案身份、標的物、意見分析、影響因素、方案
分析、方案確定、交流能力7個因子被有效納入判別
方程,判別回代結果顯示有92.6%的樣本劃分正確
量指標進行細化.并且按照民事行為能力評定的邏輯
順序進行排列.經討論和修訂后擬定量表的草稿 在
雖然初步應用研究發現該量表信效度較好.且操
作簡單,評分等級也易掌握 但是取樣中仍發現個別
案例量表分與專家鑒定結論有較大出入.且目前研究
樣本病例和案例都相對單一.導致統計分析時個別數
此基礎上通過咨詢國內司法精神病學界十位知名專
家.根據專家的意見和建議對量表二次修訂.最后經
專家討論確定初稿
從不同民事行為能力組別來看.無民事行為能力
據欠理想,尚需要進行多病種、多案例取樣進行的信
效度研究.以便于大規模推廣量表的使用
參考文獻:
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力評定分級 .中國司法鑒定,2008,(1):31—34.
組中器質性精神障礙、精神分裂癥在所占的比例明顯
高于其他疾病者
根據專家意見將民事行為能力劃分三級.完全
民事行為能力組、限制民事行為能力組、無民事行為
能力組,3組量表總分分別為2.32 ̄2.45、11.62 ̄4.01、
25.02 ̄3.90.方差分析顯示各組之間得分差異具有統
計學意義(F:526.72.P=O.000).采用LSD及SNK方
法進行兩兩比較.3組之間兩兩得分差異均具有統計
學意義 說明民事行為能力實行三級劃分是可行的
f2]張欽廷,龐艷霞,蔡偉雄,等.精神障礙者民事行為能力
標準化評定相關問題[J].證據科學,2008,16(1):111—
116.
『31張欽廷,龐艷霞,蔡偉雄,等.合同糾紛中精神障礙者民
事行為能力評定l J1.法醫學雜志,2009,25(2):95—97.
『41龐艷霞,張欽廷,蔡偉雄,等.人身損害賠償中精神障礙
精神障礙者民事行為能力評定量表各條目與總
分在評分者間有較高的一致性.kendall和諧系數為
0.649~1.000(P<0.05).表明該量表有良好的穩定性
和可靠性:全量表Cronbach OL為0.9724.表明各條
者民事行為能力評定Ⅲ.法醫學雜志,2009,25(1):24—
26.32.
(收稿日期:2010—08—09)
(本文編輯:管唯)
目具有較好的同源性.內部一致性較高 分半信度檢
(上接第348頁)
【10】Rozen S,Skaletsky HJ.Primer3 on the www f0r gener—
al users and for biologist programmers[M]//Krawetz S,
Misener S.Bioinformatics Methods and Protocols:Meth—
in Exce1.Population genetic software for teaching and
research[EB/OLI.http://www.anu.edu.au/BoZo/GenA1Ex/.
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(本文編輯:柳燕)
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