硫酸銨分級沉淀的原理【硫酸銨分級沉淀原理及實驗方案】

2024年3月15日發(作者：游樂園項目)

硫酸銨分級沉淀的原理【硫酸銨分級沉淀

原理及實驗方案】

一，基本原理

硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。用

此方法可以將主要的免疫球從樣品中分離，是免疫球蛋白分離的常用

方法。乳酸鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞

蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從氫氧化鈉中沉淀出來。

各種脂肪酸的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來氫氧化鉀

沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽濃度通常用飽和度來表

示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數小和不易使彎果而應用最為廣范。

二，試劑及儀器

1 . 組織培養上清液、血清成品或腹水等

2. 硫酸銨（ NH 4 ） SO 4

3. 飽和硫酸銨溶液（ SAS ）

4. 蒸餾水

5. PBS( 含 0.2g /L 疊氮鈉 )

6. 透析袋

7. 超速離心機

8. pH 計

9. 磁力攪拌器

三，操作步驟

以腹水或組織培養選種上清液為例來介紹抗體的硫酸銨沉淀。各

種不同的免疫球蛋白所需硫酸銨的飽和度也不完全相同。通常用來分

離抗體的硫酸銨飽和度為 33% — 50% 。

（一）配制飽和硫酸銨溶液（ SAS ）

1.將 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 邊蒸餾邊慢慢加到 1 升蒸餾水中。

用氨水或硫酸吳萸到硫酸pH7.0 。此即飽和度為 100% 的硫酸銨溶液

（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.

2.其它不同飽和度銨溶液的釀制

（二）沉淀

1.樣品（如腹水） 20 000 ′ g 離心 30 min ，除去細胞碎片；

2.保留上清液并測量體積；

3.烘烤邊攪拌邊慢慢加入等體積的 SAS 到上清液中，終濃度為

1 ： 1 （

4.將溶液磁力放在磁力攪拌器上所攪拌 6 小時或攪拌過夜（ 4 °

C ），使大分子充分沉淀。

（三）透析

1.蛋白質溶液 10 000 ′ g 離心 30 min （ 4 ° C ）。棄上清

保留沉淀；

2.將沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 疊氮鈉中。沉淀

溶解后放入透析袋對

PBS -0.2g /L 疊氮鈉透析 24-48 小時（ 4 ° C ），每隔 3-6

小時換透析緩沖液一次，以徹底除去硫酸氨；

3.透析液離心，測定上清液中蛋白質含量。

四，應用提示

（一）先用較低濃度的硫酸氨預沉淀，除去樣品中的雜受體。

1.邊攪拌邊慢慢加 SAS 到樣品溶液中，使濃度為 0.5:1 (v/v) ；

2.烤箱將溶液放在磁力攪拌器上攪拌 6 小時或過夜（ 4 ° C ）；

3.3000 ′ g 離心 30 min （ 4 °

C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次離心

得到沉淀。將沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；

4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次離心得到沉淀。將沉

淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；

5.雜蛋白與欲純化氫化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差別很大時，

用預沉淀硫酸鋰蛋白是非常有效

（二）為避免體積過大，可用固體硫酸氨成功進行鹽析（硫酸氨

用量參閱表 1 ）；硫酸氨沉淀法與層析技術結合使用，可得到更進一

步純化的抗體。

今天的實驗是利用硫酸銨沉淀蛋白質，從之前作過的經驗知道，

這一個步驟是有名的煩，要慢慢用敲的把硫酸銨之中高家嶺加入蛋白

質溶液中。

相關的原理可以在莊榮輝學習網站中找到，與鹽溶剛好相反，在

反應物蛋白質溶液中加入硫酸銨，可以會使得蛋白質的溶解度下降，

因而沉淀出來。因為硫酸銨所解離的離子容很大，所帶的電子數也多

(NH4+, SO42-)，因此當其溶入水中時，會吸引大量水分子與這些氫離

子水合。

蛋白質分子表面多少有一些較不具極性的區域，片區水分子會在

這些非極性區的表面聚集，形成類似『水籠』的構造(請見下圖)，以

便把蛋白質溶入水中。一旦蛋白質溶液加入硫酸銨，后者賺足了大量

水分子，使水籠化學鍵無法有效隔離蛋白質的非極性區，造成這些非

極性區之間的吸引，因而沉淀下來。因此，分子表面上若有越多的即

非極性區域，就越容易用硫酸銨日積月累下來。 在計算所添加的硫酸

銨的重量方面，找到了一個不太好的網站——硫酸銨計算機

這個網頁上可以靠著輸入實驗溫度、溶液體積、熔點想要到達的

百分濃度以及初始的百分濃度這四個數值，就可以得到需要添加的硫

酸銨克數，以及在加入固體硫酸銨后所增加的體積，算是一個很不錯

的網站。

此外另一個比較可資提的，是我有用兩種方式加入溴化亞，第一

種是固體的硫酸銨模碎加入，一種另一種是將硫酸銨溶成飽和溶液就

要加入，各有各的優缺點，比較如下：

1.造成蛋白質變質的程度：固體的硫酸銨>硫酸銨飽和溶液

利用硫酸銨飽和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不夠造成

變質(沒試過用倒入的)。不像固體的硫酸銨只能磨碎慢慢加入，速度

一快蛋白質就壞了(溶液伽馬射線有高能量的白色氣泡產生)。

2.操作的容易度：硫酸銨飽和溶液>>固體的硫酸銨

固體最大的缺點就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所

以當你要溶解的糖類很多時，這是很累的步驟。然而硫酸銨飽和溶液

比較麻煩只有在配制部分，要先加熱讓它飽合后，回到操作溫度讓它

過飽和，接下來用濾紙把硫酸銨結晶去掉。

3.蛋白質溶液的體積放大程度硫酸銨飽和溶液>>固體的硫

酸銨

這是使用飽和溶液最頭痛的部分，舉例來說，要讓100 ml的硫酸

銨平均數從0%到25%，如果是加入固體的硫酸銨，只會讓溶液從100

ml變成107 ml左右，但發煙硫酸若是加入硫酸銨飽和溶液，會讓溶液

變成125 ml！而且若是要不斷提高到50%，須加等量的硫酸銨飽和溶

液，所以會讓蛋白質溶液從100 ml變成200 ml。

因此在加入硫酸銨這時，若是低百分濃度可以利用硫酸銨飽和溶

液，然而如果是高百分濃度的，除非不在意蛋白質溶液體積的放大(反

正都要離心離下來)，否則欠佳還是用固體硫酸銨來的不好。